本发明专利技术公开了一种PEG‑ACS/M‑siRNA纳米复合物及其应用和降低鱼粉贮藏过程中组胺含量的方法：(1)根据鱼粉中主要的组胺产生菌摩氏摩根菌(Morganella morganii subsp.morganii KT)(CP004345)组氨酸脱羧酶基因MU9_RS17900(Gene ID:14672734)序列设计并制备小干扰核糖核酸(siRNA)；(2)以经PEG化之后的精氨酸修饰的壳聚糖为载体，得到稳定的PEG‑ACS/M‑siRNA纳米复合物；(3)将PEG‑ACS/M‑siRNA纳米复合物按一定的比例加入鱼粉中。该方法对鱼粉贮藏过程组胺含量抑制效果显著，可降低鱼粉中组胺含量的49％～53％，对饲料工业鱼粉中生物胺的控制具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物及其应用和降低鱼粉贮藏中组胺含量的方法
本专利技术属于饲料工业领域，具体涉及一种PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物的制备方法及在饲用鱼粉贮藏中的应用方法，旨在降低鱼粉贮藏中危害物组胺的含量，提升鱼粉的饲用安全。
技术介绍
鱼粉是以全鱼或鱼的下脚料为原料，经蒸煮、压榨、脱水、脱脂、干燥、粉碎等工序加工而成的粉状物。鱼粉作为优质的动物蛋白质饲料原料，其粗蛋白含量高达55％以上，同时富含多种必需氨基酸、必需脂肪酸、矿物质、维生素等。除此以外，鱼粉中还含有大量的能促进动物生长的“未知生长因子”，在饲料生产中具有重要地位。然而在贮藏过程中，鱼粉中丰富的组氨酸在组氨酸脱羧酶的作用下会发生脱羧反应而形成对动物毒害作用很强的组胺。研究表明，摩氏摩根菌的组氨酸脱羧酶活性高，是鱼粉中形成组胺的主要腐败菌种。因此，抑制摩氏摩根菌组氨酸脱羧酶的表达是抑制鱼粉中组胺形成的有效途径。组胺作为一种生物胺，可通过与细胞膜上的受体作用而发生组胺中毒。组胺的衍生物称为肌胃糜烂素，它的致病能力是组胺的100倍。据报道，2.2mg/kg肌胃糜烂素可刺激家禽的胃酸分泌造成胃部疾病，鱼肉肝脏受损等。目前降低鱼粉中组胺的主要方法有辐照法、改善加工和贮藏条件等，这些方法存在着操作要求高，成本高，效果不明显等缺点，难以在生产中应用和推广。因此，一种高效、简单、实用、安全的方法降低鱼粉中组胺含量对饲料工业有着重要的意义。RNA干扰技术是通过具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉默，阻断其基因活性。根据碱基互补配对原则，小干扰RNA(siRNA)有着很高的特异性，只对靶基因起干扰作用，对其他序列不起作用。目前siRNA的非病毒载体主要为阳离子脂质体和阳离子高分子，如聚乙烯亚胺和壳聚糖等。但脂质体和聚乙烯亚胺均具有较高的细胞毒性和体内毒性，而壳聚糖作为载体时又具有效率低下、靶向性不强等缺点。本专利技术选用改性之后的壳聚糖作为传递siRNA的载体构建的PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物，根据碱基互补配对原则，与鱼粉中主要的组胺产生菌摩氏摩根菌组氨酸脱羧酶基因的mRNA特异性结合，从而达到使组氨酸脱羧酶沉默的目的，进而抑制了鱼粉中组胺的合成，有效地延缓了鱼粉贮藏过程中的腐败进程，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物的制备方法及应用策略。通过抑制鱼粉中主要组胺产生菌摩氏摩根菌组氨酸脱羧酶基因的表达，从而降低鱼粉在贮藏过程中组胺的含量，旨在保障鱼粉的品质和安全，提供了一种高效、易操作的组胺含量降低方法。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物，根据鱼粉中主要的组胺产生菌摩氏摩根菌(Morganellamorganiisubsp.morganiiKT)(CP004345)组氨酸脱羧酶基因(MU9_RS17900GeneID:14672734)序列(SEQNO:1)设计M-siRNA，以PEG化精氨酸修饰的壳聚糖为载体，制得PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物。进一步，所述M-siRNA为双链，其序列选自以下序列：(1)正义链：5'-GGAUCGUAUUUCUGUUGAAAU-3'，反义链：5'-UUCAACAGAAAUACGAUCCAC-3'；(2)正义链：5'-GUAUUUCUGUUGAAAUCGACU-3'，反义链：5'-UCGAUUUCAACAGAAAUACGA-3'；(3)正义链：5'-GUAUCAAACGUGAAGAUUACU-3'，反义链：5'-UAAUCUUCACGUUUGAUACCG-3'。进一步，所述PEG化精氨酸修饰的壳聚糖采用以下步骤制备：精氨酸修饰壳聚糖的制备：壳聚糖溶于TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂，搅拌均匀后，再加入壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下连续室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖；PEG-ACS的制备：取精氨酸修饰的壳聚糖，加入PEG-SPA，室温下反应，使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG，得到PEG化的精氨酸修饰的壳聚糖。进一步，步骤(1)中1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺与壳聚糖等摩尔量，N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂与壳聚糖等摩尔量。进一步，PEG-ACS/M-siRNA复合物的制备包括以下步骤：(a)siRNA溶液的制备：用DEPC水溶解siRNA，制备浓度为18～25μM的siRNA溶液；(b)将PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液中，与siRNA溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液等体积混合，迅速在涡旋混合器上混合30～40s，得PEG-ACS/M-siRNA纳米粒。PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物的粒径为150～250nm。进一步，PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物的具体制备方法为：(1)根据鱼粉中主要的组胺产生菌摩氏摩根菌组氨酸脱羧酶基因MU9_RS17900靶序列：5'-GTGGATCGTATTTCTGTTGAAAT-3'，设计M-siRNA序列。(2)制备M-siRNA的序列：正义链：5'-GGAUCGUAUUUCUGUUGAAAU-3'，反义链：5'-UUCAACAGAAAUACGAUCCAC-3'。(3)精氨酸修饰的壳聚糖(ACS)的制备：将0.5～1.5g壳聚糖，溶于pH4.5～5.0的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)/盐酸缓冲溶液中，然后向该溶液中加入与壳聚糖氨基等摩尔量的1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基-丁二酰亚胺(NHS)作为偶联剂，搅拌均匀后，再加入壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应6～10h，经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖。(4)PEG化精氨酸修饰的壳聚糖(PEG-ACS)的制备：取2.5mL，10mg/mL精氨酸修饰的壳聚糖，加入25mg的PEG-SPA，室温下反应4～5h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的PEG。即得PEG化精氨酸修饰的壳聚糖，冷冻干燥备用。(5)siRNA溶液的制备：用DEPC水溶解siRNA，制备浓度为18～25μM的siRNA溶液，-20℃保存备用。siRNA反复冻融不得超过5次。(6)PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物的制备：采用复凝聚的方法制备PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物。PEG-ACS溶解于NaAc/HAc缓冲溶液(pH5.5)中，至PEG-ACS的质量分数为0.02％。将PEG-ACS溶液和siRNA溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将其等体积混合。迅速在涡旋混合器上混合30～40s，即得PEG-ACS/M-siRNA纳米粒。(7)通过动态光散射法测得纳米复合物的粒径在150～250nm之间。将制备的复合物于-20℃冷冻3～6h后冷冻干燥20～26h得到冻干粉备用。使用时，将PEG-ACS/M-siRNA冻干粉按一定比例加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PEG‑ACS/M‑siRNA纳米复合物，其特征在于，根据鱼粉中主要的组胺产生菌摩氏摩根菌(Morganella morganii subsp.morganii KT)组氨酸脱羧酶基因MU9_RS17900序列设计M‑siRNA，以PEG化精氨酸修饰的壳聚糖为载体，制备PEG‑ACS/M‑siRNA纳米复合物。
【技术特征摘要】
1.一种PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物，其特征在于，根据鱼粉中主要的组胺产生菌摩氏摩根菌(Morganellamorganiisubsp.morganiiKT)组氨酸脱羧酶基因MU9_RS17900序列设计M-siRNA，以PEG化精氨酸修饰的壳聚糖为载体，制备PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物。2.根据权利要求1所述的PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物，其特征在于，所述M-siRNA为双链，其序列选自以下序列：(1)正义链：5'-GGAUCGUAUUUCUGUUGAAAU-3'，反义链：5'-UUCAACAGAAAUACGAUCCAC-3'；(2)正义链：5'-GUAUUUCUGUUGAAAUCGACU-3'，反义链：5'-UCGAUUUCAACAGAAAUACGA-3'；(3)正义链：5'-GUAUCAAACGUGAAGAUUACU-3'，反义链：5'-UAAUCUUCACGUUUGAUACCG-3'。3.根据权利要求1所述的PEG-ACS/M-siRNA纳米复合物，其特征在于，所述PEG化精氨酸修饰的壳聚糖采用以下步骤制备：(1)精氨酸修饰壳聚糖的制备：壳聚糖溶于TEMED/HCl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基摩尔量50～100％的精氨酸，在磁力搅拌下连续室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖；(2)PEG-ACS的制备：取精氨酸修饰的壳聚糖，加入PEG-SPA，室温下反应，使用截留...
【专利技术属性】
技术研发人员：王彦波，傅玲琳，黎凡，刘忠甫，梁君波，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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