一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定发酵液中γ‑氨基丁酸的方法，其是将发酵液离心去掉固体颗粒及菌丝体，然后采用OPA溶液对所得上清液进行衍生化，再采用液相色谱对衍生化后的溶液进行测定。本发明专利技术方法可信度高，准确性好，且其中γ‑氨基丁酸衍生后的化合物的保留时间仅为3.51min，较现有标准及报道中的保留时间明显提高，可使实验周期大大缩短，具有良好推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法。
技术介绍
γ-氨基丁酸（GABA）是一种四碳非蛋白氨基酸，广泛存在于动植物中。它对人体有诸多益处，如调节血压与心率；促进营养神经系统的发育，提高脑活力；抑制谷氨酸脱羧反应，降低血氨，保护肝脏等。利用微生物发酵技术来生产γ-氨基丁酸具有成本低、产量高、安全等优点，并可作为天然食品药品添加剂。现阶段对发酵液中γ-氨基丁酸的液相测定方法衍生化操作复杂，且衍生后的γ-氨基丁酸保留时间均在12min以上，使得每个样品的检测时间较长，通常在26min以上，如果样品量较多，总测定时间通常要数十个小时，给科研工作带来不便。
技术实现思路
为克服现有文献中液相检测γ-氨基丁酸时存在的保留时间长、检测时间长的缺点，本专利技术提供了一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法，其将发酵液进行低速离心过膜衍生化后，用液相色谱法进行测定；其具体包括以下步骤：（1）发酵液的预处理：将发酵液采用4500r/min离心10min，然后用0.22μm滤膜对上清液进行过滤，收集滤液备用；（2）发酵液的衍生化：取步骤（1）中的滤液200μL，加入100μLOPA溶液，于旋转振荡器中30℃、700r/min震荡混合2min；（3）γ-氨基丁酸的测定：将步骤（2）衍生化后的溶液进行液相色谱测定；所用液相色谱的条件为：LunaC18（2）液相色谱柱（4.6×150mm，5μm），柱温40℃，紫外检测波长338nm，进样量20μL，流动相为A相（缓冲液）：B相（100%乙腈）：C相（100%甲醇）=40：30：30（v/v/v）。所述OPA溶液的配制方法为：称取0.1g邻苯二甲醛（OPA），用乙腈溶解并定容至1mL，然后加130μL巯基乙醇，用0.4mol/L的硼酸缓冲溶液定容至10mL，微孔滤膜过滤即得。所述0.4mol/L的硼酸缓冲溶液的配制方法为：准确称取2.47g硼酸（精确至0.0001g），加水约80mL，用3mol/L氢氧化钠调pH至10.2±0.05，再加去离子水定容至100mL。流动相中所述缓冲液的配制方法为：称取8.0g结晶乙酸钠，加990mL去离子水，再依次加入3.2mL四氢呋喃、138μL三乙胺，用7%（v/v）的乙酸调pH至7.20±0.05，最后加去离子水定容至1L，微孔滤膜过滤后超声备用。本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术中样品的前处理简单，衍生化操作便捷，液相色谱的流动相配制简单，有利于实验的开展；（2）本专利技术所采用液相色谱条件具有较好的加标回收率，能够对γ-氨基丁酸进行准确测定，同时其可大大缩短衍生后γ-氨基丁酸的保留时间，其保留时间仅为3.51min，节省了时间成本，利于大量样品的快速检测。附图说明图1为采用行业标准测定的γ-氨基丁酸衍生前的液相色谱图；图2为采用行业标准测定的衍生后γ-氨基丁酸的液相色谱图；图3为采用本专利技术方法测定的衍生后γ-氨基丁酸的液相色谱图；图4为本专利技术中衍生后γ-氨基丁酸的标准曲线。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。实施例1（1）红曲发酵液的预处理：将红曲发酵液4500r/min离心10min，用0.22μm滤膜对上清液进行过滤，收集滤液备用；所述红曲发酵液是将红曲霉孢子接种于液态培养基中，30℃、200r/min摇床培养6天（所用液态培养基配方为：味精22.33g，硫酸铵9.72g，籼米粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH）；（2）红曲发酵液的衍生化：取步骤（1）中的滤液200μL，加入100μLOPA溶液，于旋转振荡器中30℃、700r/min震荡2min；所述OPA溶液的制备方法为：称取0.1g邻苯二甲醛（OPA），用乙腈溶解并定容至1mL，加130μL巯基乙醇，用0.4mol/L硼酸缓冲溶液定容至10mL，微孔滤膜过滤后备用；所述0.4mol/L硼酸缓冲溶液的制备方法为：准确称取2.47g硼酸（精确至0.0001g），加水约80mL，用3mol/L氢氧化钠调pH至10.2±0.05，再加去离子水定容至100mL备用；（3）γ-氨基丁酸的测定：将衍生后的溶液进行液相色谱测定；液相色谱的条件为：LunaC18（2）液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温40℃，紫外检测波长338nm，进样量20μL，流动相为A相（缓冲液）：B相（100%乙腈）：C相（100%甲醇）=40：30：30；流动相A相（缓冲液）的配制方法为：称取8.0g结晶乙酸钠，加去离子水约990mL，再依次加入3.2mL四氢呋喃、138μL三乙胺，用7%（v/v）的乙酸调pH至7.20±0.05，最后加去离子水定容至1L，微孔滤膜过滤后超声备用。1.采用国家轻工业行业标准QB/T4587-2013分别对衍生化前、后的γ-氨基丁酸进行测定，其液相分析条件为：柱子：C18150×4.6mm，40℃柱温，紫外检测波长338nm；流动相A：称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解并定容至1L；然后加入220μL三乙胺，搅拌并滴加5%醋酸调pH至7.2；最后加入5mL四氢呋喃，混合过膜，备用；流动相B：称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解并定容至1L；滴加2%醋酸将pH调至7.2；再按乙酸钠溶液：乙腈：甲醇=1：2：2的体积比混合后过膜，备用。流动相的洗脱方法如表1所示：表1梯度洗脱方法20μL样品溶液与5μLOPA溶液混合2min后进样。所得结果见图1、2。由图1、2可见，采用此方法进行梯度洗脱时，液相色谱的基线在后期均会发生漂移。γ-氨基丁酸的保留时间为25.60min左右，衍生化后物质的保留时间为24.59min。γ-氨基丁酸的峰面积从1973838减小至1576172，表明部分γ-氨基丁酸已被衍生化，可能衍生剂用量过低，同时衍生后的γ-氨基丁酸的峰面积由于底部与其他杂质峰混合，难以对目标峰的峰面积进行准确计算，从而无法得出样品中γ-氨基丁酸的准确含量。图3为采用本专利技术方法检测衍生后γ-氨基丁酸所得的液相色谱图。从图中可以看出，出峰形状较尖，无裂峰，不拖尾，且出峰时间早，仅为3.51min，相较于行标中衍生物的保留时间（24.59min）提早了21.08min，并且峰形良好，无杂峰干扰，可进行峰面积计算，说明该方法可实现γ-氨基丁酸的快速测定。2.在此基础上进行标准曲线的测定，所得标准曲线如图4所示。标准曲线的R平方为0.9993，线性较好。3.对改进后的方法进行回收率测定，测定结果如表2。表2样品加标回收率检测结果对样品进行加标后，加标回收率在95%~105%范围内则说明方法的可信度高，其他因素的干扰小。由表2可见，该方法下所出的峰基本为GABA与OPA的衍生峰。综上，本专利技术方法能够对GABA与OPA衍生后的峰进行良好分离，其保留时间短，方法可行。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利技术的涵盖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速测定发酵液中γ‑氨基丁酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）发酵液的预处理：将发酵液采用4500r/min离心10min，然后用0.22μm滤膜对上清液进行过滤，收集滤液备用；（2）发酵液的衍生化：取步骤（1）中的滤液200μL，加入100μL OPA溶液，于30℃、700r/min条件下震荡混合2min；（3）γ‑氨基丁酸的测定：将步骤（2）衍生化后的溶液进行液相色谱测定。

【技术特征摘要】
1.一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）发酵液的预处理：将发酵液采用4500r/min离心10min，然后用0.22μm滤膜对上清液进行过滤，收集滤液备用；（2）发酵液的衍生化：取步骤（1）中的滤液200μL，加入100μLOPA溶液，于30℃、700r/min条件下震荡混合2min；（3）γ-氨基丁酸的测定：将步骤（2）衍生化后的溶液进行液相色谱测定。2.根据权利要求1所述的快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述OPA溶液的配制方法为：称取0.1g邻苯二甲醛，用乙腈溶解并定容至1mL，然后加130μL巯基乙醇，用0.4mol/L的...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪莉，周康熙，陈丽，何冬萍，刘志彬，张雯，张晨，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35