一种茶树脱毒组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种茶树脱毒组织培养方法，包括如下步骤：（1）选材：春季选取无腐无病害、当年生健壮枝条；（2）表面处理：将茶树芽外植体进行清洗、消毒；（3）消毒；（4）切割；（5）初代培养：接种至培养基Ⅰ上进行培养；（6）增殖继代：将无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖继代培养；（7）生根培养；（8）驯化炼苗。本发明专利技术的有益效果是：1.通过本方法进行的茶树组织培养，确定了组织培养中控制分化、继代生长、生根等的培养基成分，研究确定了生长调节物质的种类、浓度以及培养条件的最佳优化选择，攻克了茶树组织培养过程中的技术壁垒，解决了茶树离体再生困难、遗传转化效率低的技术难题，达到很好的培养效果。

【技术实现步骤摘要】
一种茶树脱毒组织培养方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体的说涉及一种茶树脱毒组织培养方法。
技术介绍
茶树属多年生木本植物，具有生育周期长、自交亲和性低、花期短、连锁性状难以分开、有益突变率低等性状，使传统育种方法受到诸多限制，因此利用遗传转化途径进行茶树品种改良越来越受到研究者的青睐，而组织培养可提供大量基因转移的理想受体，成为研究转基因植物的常用材料。然而，目前对茶树遗传转化研究的成功案例很少，其主要原因是茶树离体再生困难、转化效率极低。茶树生长速度慢，增值率、成苗率较低，在组培工作中仍存在许多亟待解决的问题。在植物组织培养过程中常会出现褐变、黄化、玻璃苗、畸形胚、污染等许多问题，影响实验结果，甚至导致实验失败，也阻碍了组培快繁技术的应用，给科研和生产造成损失，迫切需要解决。中国专利CN2016101044044专利技术公开了一种茶树幼叶组织培养的方法，其方法是将消毒后的茶树幼叶外植体接种于不含琼脂的液体培养基上，所述外植体在切割时，叶缘0.5-1cm处不切断，再将所述外植体接种于液体培养基暗培养3d后转接到固体培养基上暗培养11-13d，通过这种方法处理过的外植体褐化率为32％，萌芽率高达68％；本专利技术利用液固共培养和暗培养相结合的办法，明显降低茶树组织培养过程中外植体褐化率，显著提高萌芽率和效率，但不能彻底解决黄化、畸形等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述茶树组织培养的缺陷，对茶树的脱毒组织培养方法进行系统的研究，经过大量实验，得到一种操作简便、提高茶树产量与品质的培养方法。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种茶树脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：春季选取无腐无病害、当年生健壮15~20cm枝条，将枝条剪成带1个腋芽的健壮小段作为外植体；(2)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用5%吐温-80浸泡20min，采用流水冲洗干净；(3)消毒：根据外植体的老嫩程度，老的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒10~20min，无菌水冲洗干净；嫩的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒3~5min，无菌水冲洗干净；(4)切割：将消毒好的外植体切口进行更新处理，去掉大的苞叶；(5)初代培养：将处理好的外植体接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照10~16h、光照强度为5000~6000Lux、培养30~45d；(6)增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为5000~7000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；(7)生根：选取长势健壮的茶树苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为6000Lux的环境中，培养20~30d；(8)驯化炼苗：将步骤(7)得到的根系发达的茶树苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85%~95%，7天后湿度递减至80%，此后逐步递减，15天后将茶树苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；其中：培养基Ⅰ为White改良培养基中添加1.0~3.0mg/LBA、0.5~1.5mg/LTDZ、0.01~0.2mg/LGA3、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅱ为White改良培养基中添加1.0mg/LBA、0.3mg/LGA3、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；培养基Ⅲ为White改良培养基中添加2.0mg/LNAA、0.5mg/LIBA、25g/L蔗糖和4.5g/L琼脂。作为优化的，一种茶树脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：春季选取无腐无病害、当年生健壮15~20cm枝条，将枝条剪成带1个腋芽的健壮小段作为外植体；(2)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用5%吐温-80浸泡20min，采用流水冲洗干净；(3)消毒：根据外植体的老嫩程度，老的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒10~20min，无菌水冲洗干净；嫩的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒3~5min，无菌水冲洗干净；(4)切割：将消毒好的外植体切口进行更新处理，去掉大的苞叶；(5)初代培养：将处理好的外植体接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照14h、光照强度为5000~6000Lux、培养35~40d；(6)增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照12h、光照强度为5000~7000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；(7)生根：选取长势健壮的茶树苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照12h、光照强度为5000~7000Lux的环境中，培养25d；(8)驯化炼苗：将步骤(7)得到的根系发达的茶树苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85%~95%，7天后湿度递减至80%，此后逐步递减，15天后将茶树苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；作为优化的，所述培养基Ⅰ为White改良培养基中添加2.0mg/LBA、1.0mg/LTDZ、0.1mg/LGA3、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；作为优化的，所述培养基Ⅱ为White改良培养基中添加1.0mg/LBA、0.3mg/LGA3、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；作为优化的，所述培养基Ⅲ为White改良培养基中添加2.0mg/LNAA、0.5mg/LIBA、25g/L蔗糖和4.5g/L琼脂。作为优化的，所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。作为优化的，所述一种茶树脱毒组织培养方法还包括抗生素处理，在步骤（5）初代培养用到的培养基Ⅰ中加入特美汀。作为优化的，所述特美汀的添加量为100~500mg/L。White改良培养基是1963年由White改进的，较White培养基提高了MgSO4的浓度和增加了硼素，由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成，其特点是无机盐数量较低。萘乙酸(NAA)：是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果等，可随营养流输导到作用部位。6-苄基腺嘌呤（BA）：一种广泛使用的添加于植物生长培养基的细胞分裂素，是第一个人工合成的细胞分裂素，能够促进蛋白质等生物合成和细胞分裂，延缓叶片衰老，调节细胞分化、延缓蛋白质和叶绿素降解，具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老、防衰保鲜作用。吲哚丁酸（IBA）：植物生长调节剂，用于细胞分裂和细胞增生，促进草本和木本植物的根的分生。苯基脲衍生物(TDZ)：已被广泛用于植物组织培养形态发生的高效生物调节剂，它能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能。许多研究报告指出TDZ通过调节内源植物生长激素起作用，或者是诱导逆境产生起间接作用，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茶树脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：春季选取无腐无病害、当年生健壮枝条，枝条长度15~20cm，将枝条剪成带1个腋芽的健壮小段作为外植体；(2)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用5%吐温‑80浸泡20min，采用流水冲洗干净；(3)消毒：根据外植体的老嫩程度，老的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒10~20min，无菌水冲洗干净；嫩的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒3~5min，无菌水冲洗干净；(4)切割：将消毒好的外植体切口进行更新处理，去掉大的苞叶；(5)初代培养：将处理好的外植体接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照10~16h、光照强度为5000~6000Lux、培养30~45d；(6)增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为5000~7000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；(7)生根：选取长势健壮的的茶树苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为5000~7000Lux的环境中，培养20~30d；(8)驯化炼苗：将步骤(7)得到的根系发达的茶树苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85%~95%，7天后湿度递减至80%，此后逐步递减，15天后将茶树苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；其中：培养基Ⅰ为White改良培养基中添加1.0~3.0mg/LBA、0.5~1.5mg/LTDZ、0.01~0.2mg/LGA3、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅱ为White改良培养基中添加0.5~2.0mg/LBA、0.1~0.5mg/LGA3、0.1~1mg/LNAA、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅲ为White改良培养基中添加1.0~3.0mg/LNAA、0.1~1.0mg/LIBA、20~30g/L蔗糖和3~6g/L琼脂。...

【技术特征摘要】
1.一种茶树脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：春季选取无腐无病害、当年生健壮枝条，枝条长度15~20cm，将枝条剪成带1个腋芽的健壮小段作为外植体；(2)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用5%吐温-80浸泡20min，采用流水冲洗干净；(3)消毒：根据外植体的老嫩程度，老的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒10~20min，无菌水冲洗干净；嫩的外植体的采用75%酒精消毒1~5min、0.1%HgCl溶液消毒3~5min，无菌水冲洗干净；(4)切割：将消毒好的外植体切口进行更新处理，去掉大的苞叶；(5)初代培养：将处理好的外植体接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照10~16h、光照强度为5000~6000Lux、培养30~45d；(6)增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为5000~7000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；(7)生根：选取长势健壮的的茶树苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为5000~7000Lux的环境中，培养20~30d；(8)驯化炼苗：将步骤(7)得到的根系发达的茶树苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85%~95%，7天后湿度递减至80%，此后逐步递减，15天后将茶树苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；其中：培养基Ⅰ为White改良培养基中添加1.0~3.0mg/LBA、0.5~1.5mg/LTDZ、0.01~0.2mg/LGA3、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅱ为White改良培养基中添加0.5~2.0mg/LBA、0.1~0.5mg/LGA3、0.1~1mg/LNAA、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅲ为White改良培养基中添加1.0~3.0mg/LNAA、0.1~1.0mg/LIBA、20~30g/L蔗糖和3~6g/L琼脂。2.根据权利要求1所述的一种茶树脱毒组织培养方法，其特征在于：一种茶树脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：春季选取无腐无病害、当年生健壮15~20cm枝条，将枝条剪成带1个腋芽的健壮小段作为外植体；(2)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用5%吐温-80浸泡20min，采用流水冲洗干净；(3)消毒：根据外植体的老嫩程度，老的外植体...

【专利技术属性】
技术研发人员：金红梅，李亚，周宇洋，
申请(专利权)人：济南亚龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37