一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法技术

本发明专利技术公开了一种柳杉茎段外植体愈伤组织诱导及植株再生方法，该方法包括以下步骤：选取柳杉组培苗茎段为组织培养材料，将组培苗茎段接入到愈伤组织诱导培养基；待愈伤组织诱导出来以后，将愈伤组织接入到分化培养基上进行不定芽的诱导；不定芽诱导出来以后转入DCR基本培养上进行不定芽和不定根的生长。与现有技术中的柳杉组培方法相比，本发明专利技术的柳杉组培苗茎段再生植株培养方法优势在于：有效解决了柳杉外植体在组织培养条件下通过愈伤组织途径植株再生问题，实现了柳杉稳定高效的组培体系，为加快柳杉组培苗植株再生提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法
本专利技术属于植物组培
，具体涉及一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法。
技术介绍
柳杉(Cryptomeriafortunei)在全世界范围内共有两种，大部分植物分类学家认为柳杉属分为柳杉(C.fortunei)和日本柳杉(C.japonica)。柳杉为我国所特有的树种，产于浙江、福建及江西等地海拔1100m以下的地带。在江苏南部、浙江、安徽、河南、湖北、广西及广东等地均有栽培，且生长良好。柳杉作为我国南方重要的绿化针叶树种，其树干高大，材质轻软，纹理直，强度较强，干缩率小，易干燥，耐腐蚀性较强，在用材和环境保护等各方面都有着优秀的表现，且在环境保护方面主要对酸雨有着较强的抗性，对空气的净化、负离子效应等方面有着显著贡献，且柳杉精油对黑胸白蚁也有着毒杀性。目前国内市场对柳杉需求量较大，然而柳杉在我国主要采用常规的繁育方法，对一些优良性状的不能很好的保存，发挥和应用。因此，开展柳杉属的无性繁育的研究是很有必要的。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，以柳杉优良无性系的茎段为组织培养材料，进行愈伤组织的诱导及植株再生，为柳杉良种的增殖扩繁提供理论和技术的支持。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，包括以下步骤：1)选取柳杉优良无性系组培苗的茎段为组织培养材料，将茎段的针叶剪除，取3～4cm长的茎段接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的茎段脱分化为愈伤组织，其中，愈伤组织诱导培养基配方为：改良DCR+2，4-D0.5-2.0mg/L+6-BA0.1-1.5mg/L+水解酪蛋白400-600mg/L+L-谷氨酰胺400-600mg/L+30-40g/L蔗糖；2)将愈伤组织接入继代培养基进行继代增殖培养；柳杉茎段诱导愈伤组织的继代增殖培养基配方为改良DCR+2，4-D0.5-2.0mg/L+6-BA0.1-1.5mg/L+25-35g/L蔗糖；3)将柳杉茎段诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基，诱导培养产生不定芽；不定芽诱导培养基为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA1.2mg/L；4)待不定芽长到2-3cm时，从愈伤组织上切下，将不定芽转入生长培养基进行不定芽与不定根的生长培养，生长培养基为DCR基本培养基。步骤1)中，愈伤组织诱导培养基配方为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺400mg/L+40g/L蔗糖。步骤1)中，柳杉优良无性系为011号无性系，培养条件为25℃，暗培养。步骤2)中，继代增殖培养基配方为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+30g/L蔗糖。步骤2)中，愈伤组织在改良DCR+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2，4-D、改良DCR+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2，4-D两种培养基交替进行继代培养，愈伤组织能保持较好的状态和增殖速度。步骤2)中，20d继代一次。步骤3)中，不定芽诱导培养基为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA1.2mg/L+1.0mg/LKT+0.05mg/LNAA。步骤4)中，28d，DCR基本培养基上成功长出新的不定芽与不定根，生根后，进行常规培养，即可植株的再生和培育成苗。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，有效解决了柳杉外植体在组织培养条件下通过愈伤组织途径植株再生问题，实现了柳杉稳定高效的组培体系，为加快柳杉组培苗植株再生提供技术支撑。附图说明图1是不同无性系在愈伤诱导培养基上的状态图；图中，A：59号愈伤组织诱导状态，B：011号外植体诱导出的愈伤组织；图2是愈伤组织在不同培养基上的继代状态图；图中，A：愈伤组织在最佳培养基上继代的状态，显微镜下20×下观察；B：愈伤组织长期在诱导培养基上继代的状态，显微镜下12.5×下观察；图3是组培苗茎段愈伤组织分化不定芽过程图；图中，A：愈伤组织出现叶片，显微镜下16×观察；B：愈伤组织上长出不定芽，显微镜下10×观察；C：完整不定芽，在显微镜下10×观察；D：不定芽完全长出，显微镜下12.5×观察；图4是组培苗茎段愈伤组织的不定芽增殖与不定根生成情况图；图中，(A：愈伤组织诱导出的不定芽切下转入DCR基本培养基进行不定芽增殖；B：经过28d的培养，外植体不定芽伸且不定根长出；图5是添加ABA与肌醇增殖继代结果图；图中，A愈伤组织在ABA最佳浓度，B愈伤组织在肌醇最佳浓度。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，具体步骤如下：1)茎段愈伤组织诱导选取柳杉优良无性系011号(日本)和59号(浙江石垟)组培苗的茎段为组织培养材料，将茎段的针叶剪除，取3～4cm长的茎段接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的茎段脱分化为愈伤组织，其中，愈伤组织诱导培养基配方为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L+L-谷氨酰胺400mg/L+蔗糖4％；培养条件为25℃，暗培养，一般培养15天左右茎段脱分化形成愈伤组织。如图1所示，011号无性系(图1B)在愈伤组织诱导培养基上愈伤诱导率为100％，在15d的时候可看见愈伤组织，愈伤表面圆润有光泽、白色略透明、结构紧密，在25d时，愈伤组织颜色变为淡黄或淡绿，表面圆润、较干燥，结构紧密，颗粒状突起，增殖速度较快。59号无性系(图1A)在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织出现时间较迟，大约在40d左右出现，愈伤诱导量小，外植体易褐化死亡，增值速度较慢，愈伤组织质地松软、白色或淡黄色、表面干燥，部分愈伤组织略湿润、无粘性。2)愈伤组织继代培养本实施例继代培养过程中，愈伤组织在诱导培养基上长期继代会出现增殖速度缓慢，颗粒状突起与针状突起并存的现象，为了更好的从愈伤组织上直接诱导出不定芽，本实施例对2，4-D与6-BA的浓度进行了相应的调整，试验结果表明：愈伤组织在2，4-D2.0mg/L、6-BA0.5mg/L与2，4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L这两种浓度交相继代的时候，愈伤组织能保持较好的状态和增殖速度，愈伤表面圆润、干燥，颗粒状突起，结构紧密(图2A)。长期在诱导培养基上的愈伤组织会出现表面湿润，针状突起，质地松软的状态(图2B)。因此，综合考虑后，011号无性系组培苗茎段诱导的愈伤组织的继代培养基应选取：改良DCR+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2，4-D、改良DCR+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2，4-D两种培养基交替进行继代培养，可以使得愈伤组织状态保持最佳，增殖速度也是最快的状态。适宜的继代周期对愈伤组织的保持与增殖有着至关重要的作用，同时也可以有效抑制愈伤组织的褐化。本实施例的结果表明：20d继代一次是最佳的继代周期。具体的试验结果见表1。表1不同继代时间对愈伤组织的影响3)由愈伤组织诱导不定芽将柳杉茎段诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基，愈伤组织在不定芽诱导培养基上经过一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选取柳杉优良无性系组培苗的茎段为组织培养材料，将茎段的针叶剪除，取3～4cm长的茎段接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的茎段脱分化为愈伤组织，其中，愈伤组织诱导培养基配方为：改良DCR+2，4‑D 0.5‑2.0mg/L+6‑BA 0.1‑1.5mg/L+水解酪蛋白400‑600mg/L+L‑谷氨酰胺400‑600mg/L+30‑40g/L蔗糖；2)将愈伤组织接入继代培养基进行继代增殖培养；柳杉茎段诱导愈伤组织的继代增殖培养基配方为改良DCR+2，4‑D 0.5‑2.0mg/L+6‑BA 0.1‑1.5mg/L+25‑35g/L蔗糖；3)将柳杉茎段诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基，诱导培养产生不定芽；不定芽诱导培养基为：改良DCR+2，4‑D 1.0mg/L+6‑BA 1.2mg/L；4)待不定芽长到2‑3cm时，从愈伤组织上切下，将不定芽转入生长培养基进行不定芽与不定根的生长培养，生长培养基为DCR基本培养基。

【技术特征摘要】
1.一种柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选取柳杉优良无性系组培苗的茎段为组织培养材料，将茎段的针叶剪除，取3～4cm长的茎段接入愈伤组织诱导培养基培养，使高度分化的茎段脱分化为愈伤组织，其中，愈伤组织诱导培养基配方为：改良DCR+2，4-D0.5-2.0mg/L+6-BA0.1-1.5mg/L+水解酪蛋白400-600mg/L+L-谷氨酰胺400-600mg/L+30-40g/L蔗糖；2)将愈伤组织接入继代培养基进行继代增殖培养；柳杉茎段诱导愈伤组织的继代增殖培养基配方为改良DCR+2，4-D0.5-2.0mg/L+6-BA0.1-1.5mg/L+25-35g/L蔗糖；3)将柳杉茎段诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基，诱导培养产生不定芽；不定芽诱导培养基为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA1.2mg/L；4)待不定芽长到2-3cm时，从愈伤组织上切下，将不定芽转入生长培养基进行不定芽与不定根的生长培养，生长培养基为DCR基本培养基。2.根据权利要求1所述的柳杉茎段愈伤组织诱导及植株再生培养方法，其特征在于：步骤1)中，愈伤组织诱导培养基配方为：改良DCR+2，4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺400mg/L+40g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，董京，陈金慧，施季森，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32