用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，包括步骤：(1)将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；(2)将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。采用了本发明专利技术的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，可以模拟生理微环境，用于更好地理解结直肠癌转移过程中粘附和侵袭能力的变化，将完善现用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型，且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解。

【技术实现步骤摘要】
用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法
本专利技术涉及生物
，具体是指一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法。
技术介绍
20多年，中国和其他经济转变型国家的结肠癌发病率在不断上升，主要的原因是环境因素和人的生活和饮食习惯的改变而引起的。结直肠癌已经成为世界常见恶性肿瘤之一，发病率占胃肠道肿瘤的第3位的结肠癌，其复发与转移是临床上急需解决的问题。研究发现，腹膜转移的发生是癌细胞经血路腹膜转移或腹膜直接种植生长所致。临床表明，患者出现腹膜转移的情况下，病情发展加快、预后差，多需采用联合治疗措施。胃肠道肿瘤细胞之所以容易发生手术后腹膜转移，是因为腹膜腔表面覆盖着一层间皮细胞，当脱落的肿瘤细胞接触到间皮细胞时，就会粘附在上面，侵入腹膜，逐渐形成新的肿瘤。虽然已经建立的动物模型可以用于体内药物的筛选，但是对于体外研究以及早起分子标志物的发现仍存在一定的弊端。鉴于肿瘤转移是一个极其复杂的过程，它包括细胞外基质、细胞粘附性能改变、肿瘤血管形成、细胞存活等几个方面。二维(2D)表面细胞的培养为基础细胞生物学和肿瘤发生提供了突破性的见解。然而，在这些简化的条件下，器官或肿瘤的大多数生理参数(例如组织结构，细胞与细胞和细胞与基质的相互作用，机械性质以及生物化学网络)都丧失了。近期的研究都在检测癌细胞间的相互作用时，细胞外基质和间皮细胞也需要进一步的加入研究中。目前没有研究完成细胞外基质或间皮细胞的体外培养实验。并且，目前的研究并没有明确成纤维细胞在癌细胞粘附和侵袭过程中的作用。此外，大多数研究只进行了癌细胞转移到腹膜的研究，然后仅仅推测转移的作用机制是和其他转移(如，肝转移)是相似的。然而，目前并不清楚为什么结肠癌有一个对腹膜转移的倾向，为什么结肠癌转移到腹膜比其他位点更容易发生。本专利技术致力于提出一个新型的模拟体内结肠癌抚摸转移的体外三维模型，用来研究结肠癌腹膜转移过程中的微环境存在的作用以及早期结肠癌转移标志物的寻找和探索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种完善用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型、且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法。为了实现上述目的，本专利技术的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法如下：所述的方法包括步骤：(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。较佳地，所述的步骤(1)中的成纤维细胞为原代腹膜成纤维细胞；所述的步骤(1)中的I型胶原为I型鼠尾胶原蛋白；所述的步骤(2)中的间皮细胞为原代腹膜间皮细胞；所述的步骤(3)中的结肠癌细胞为结肠癌细胞HCT116。较佳地，所述的步骤(1)的具体步骤为：准备好悬浮于培养液的成纤维细胞，并放置于冰浴中，将I型胶原加到0.1mol/LNaOH中，立即混匀，再加入10×PBS或10×培养液，混匀，混匀后pH为7左右，加入成纤维细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。在所述的体外三维模型中，每100ul培养基中成纤维细胞的个数为100～200个。较佳地，在所述的体外三维模型中，间皮细胞贴壁伸展后在成纤维细胞-I型胶原复合体表面形成融合层，且所述的融合层完全覆盖所述的成纤维细胞-I型胶原复合体表面。较佳地，所述的方法在无菌环境中进行。较佳地，所述的步骤(1)中的成纤维细胞和所述的步骤(2)中的间皮细胞传代均不可超过10代。较佳地，所述的步骤(1)中的成纤维细胞和所述的步骤(2)中的间皮细胞均通过形态学、免疫荧光法鉴定。较佳地，所述的步骤(3)中的结肠癌细胞使用荧光标记。采用了本专利技术的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，可以模拟生理微环境，用于更好地理解结直肠癌转移过程中粘附和侵袭能力的变化，它结合了胞外基质、原代人间皮细胞和原代人腹膜成纤维细胞来研究基质和胞外基质两者在转移过程的作用，用于研究人间皮细胞以及人成纤维细胞在结直肠癌细胞粘附侵袭这个过程中的作用，以及共培养体系下，癌细胞对正常细胞是否有一定的促进其癌变的过程，将完善现用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型，且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解。附图说明图1为显微镜白光拍摄下组织分离提取的原代人腹膜间皮细胞细胞形态。图2为显微镜白光拍摄下组织分离提取的原代人成纤维细胞细胞形态。图3为免疫荧光法鉴定腹膜间皮细胞：角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)抗原阳性，脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylase)阴性。图4为免疫荧光法鉴定腹膜成纤维细胞：角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)、脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylase)抗原阳性。图5为所建立的3D模型示意图，主要由成纤维细胞、间皮细胞和结肠癌细胞组成，将成纤维细胞包埋在I型胶原中，在顶部铺上一层间皮细胞的融合层，并将癌细胞铺于最上层。图6为用荧光标记的HCT116细胞检测2D和3D培养体系中癌细胞对药物敏感性的差异。图7为用荧光标记的HCT116细胞在2D和3D培养模型中分别进行粘附能力测定，通过荧光显微镜测定粘附细胞的数量。图8为用荧光标记的HCT116细胞在2D和3D培养模型中分别测定侵袭能力测定，通过荧光显微镜测定侵入细胞的数量。具体实施方式为了能够更清楚地描述本专利技术的
技术实现思路
，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。本专利技术的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法包括步骤：(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。其中，所述的步骤(1)中的成纤维细胞为原代腹膜成纤维细胞；所述的步骤(2)中的间皮细胞为原代腹膜间皮细胞。本专利技术提供一种腹膜间皮细胞原代培养，具体包括：1)腹膜间皮细胞的提取分离无菌腹部手术摘除的腹膜组织，将剪取血管脂肪相对较少的腹膜组织置于无菌培养皿内，用无菌PBS漂洗3次后，用剪子剪成3cm*3cm大小，将剪取的腹膜组织置于含500U/ml的青霉素和500ug/ml链霉素的PBS磷酸盐缓冲液中浸泡20min，然后用PBS冲洗5min，将漂洗后的组织平铺于无菌培养皿内，再用PBS反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的组织剪成1cm*1cm大小，小块放入50ml培养瓶内，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA细胞消化液20ml孵育，放置于37℃，5％CO2培养箱内消化25min，每5min振荡一次，最后5min保持静止。消化结束后将消化液用100目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含20％的小牛血清的RPMI1640培养基终止消化。用移液器分装于10ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞沉淀，分装于50ml细胞培养瓶中，放置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱内培养。2)腹膜间皮细胞传代培养原代细胞培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。

【技术特征摘要】
1.一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。2.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的成纤维细胞为原代腹膜成纤维细胞；所述的步骤(1)中的I型胶原为I型鼠尾胶原蛋白；所述的步骤(2)中的间皮细胞为原代腹膜间皮细胞；所述的步骤(3)中的结肠癌细胞为结肠癌细胞HCT116。3.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(1)的具体步骤为：准备好悬浮于培养液的成纤维细胞，并放置于冰浴中，将I型胶原加到0.1mol/LNaOH中，立即混匀，再加入10×PBS或10×培养液，混匀，混匀后pH为7，加入成纤维细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建文，李月琪，梁欣，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31