一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种生成细胞的方法，具体涉及一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用，属于生物技术领域；本发明专利技术所述方法将iPS细胞消化为单细胞，利用三维培养板生成形态和大小均一的拟胚体，将分化前14天早期诱导过程由2D平面贴壁改为3D悬浮培养，减少了分化过程中上皮样细胞发生的比例，提高了黑素细胞的分化效率，对分化前拟胚体的选择、单细胞消化时间点以及培养基成分均进行了优化，改善了黑素细胞的增殖状态；本发明专利技术所获得的黑素细胞在体外具有与正常黑素细胞高度接近的特征，而在体内移植过程中具有显著优于正常黑素细胞的特性。

【技术实现步骤摘要】
一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用
本专利技术涉及一种生成细胞的方法，具体涉及一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用，属于生物

技术介绍
黑素细胞是一种唯一能生成黑色素以保护皮肤细胞抵抗紫外线的细胞类型。人类黑素细胞能够直接从表皮分离获得，然而，其在表皮中的数量极其有限，加上在体外增殖能力弱等特点，大大限制了黑素细胞在自体细胞移植治疗、药物筛选等方面的应用。除表皮之外，黑素细胞还能够通过其他途径分化获得，如黑素干细胞和黑素前体细胞、真皮干细胞、毛囊干细胞、毛囊外毛根鞘干细胞、胚胎神经嵴干细胞以及胚胎干细胞等。然而，这些方法存在各自的缺点，如黑素干细胞、真皮干细胞及毛囊相关的干细胞在皮肤中的数量极少，同时不具有无限增殖的能力，因此获得的黑素细胞数量十分有限。而胚胎来源的干细胞虽然能够无限增殖，但存在伦理争议，而且无法获得用于患者移植的自体黑素细胞。此外，通过重编程的手段也能够使皮肤成纤维细胞或角质形成细胞直接转分化，获得具有一定功能的黑素细胞。但是目前的转分化系统效率极低，加上获得的细胞功能与正常黑素细胞存在一定差距，因此应用受到限制。诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：a．单细胞法制作拟胚体：iPS细胞克隆生长，加入iPS单细胞消化酶，加入mTeSR培养基，吹打成iPS单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mTeSR培养基重悬计数获得iPS单细胞，将iPS单细胞接种至三维培养板内培养，添加ROCK抑制剂，培养得到形态大小均一的拟胚体；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板中继续维持培养，每天换液；b．3D悬浮诱导分化：（1）3D早期诱导：将步骤a中得到的拟胚体放入分化培养基中进行早期诱导分化；（2）中期诱导贴壁:将上述步骤b（1）中早期诱导分化后的拟胚体转移至纤维粘连蛋白包被的培养板中，...

【技术特征摘要】
1.一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：a．单细胞法制作拟胚体：iPS细胞克隆生长，加入iPS单细胞消化酶，加入mTeSR培养基，吹打成iPS单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mTeSR培养基重悬计数获得iPS单细胞，将iPS单细胞接种至三维培养板内培养，添加ROCK抑制剂，培养得到形态大小均一的拟胚体；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板中继续维持培养，每天换液；b．3D悬浮诱导分化：（1）3D早期诱导：将步骤a中得到的拟胚体放入分化培养基中进行早期诱导分化；（2）中期诱导贴壁:将上述步骤b（1）中早期诱导分化后的拟胚体转移至纤维粘连蛋白包被的培养板中，中期贴壁培养，分化培养基组分不变,拟胚体贴壁生长；（3）后期诱导:将上述步骤b（2）中贴壁培养后的拟胚体用消化酶消化成单细胞，接种至纤维粘连蛋白包被过的培养板中，在优化后的分化培养基中进行后期成熟诱导，当细胞密度达90%时，用消化酶消化传代，分化第35-42天时，得到成熟黑素细胞。2.根据权利要求1所述的一种生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述iPS单细胞接种至三维培养板是接种至24孔ElplasiaTM三维板中，每孔接种密度为5×105个细胞。3.根据权利要求1所述的一种生成自体黑素细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述维持培养是培养时间为5-10天，拟...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘莉萍，李遇梅，郑允文，郭宁宁，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32