末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法技术

本发明专利技术公布一末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，包括待测样本的前处理：取末梢血样品加入含有内标溶液，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心上清液，室温下氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后离心得到待测样本；以及超高效液相色谱串联质谱检测：通过超高效液相色谱串联质谱检测获得所述待测样本中待测物的峰面积和对应内标峰面积，本发明专利技术提供的微量检测方法可以在2分钟内完成微量末梢血样本中维生素A和维生素E的快速高效检测。

【技术实现步骤摘要】
末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法
本专利技术涉及维生素检测领域，具体涉及一种末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法。
技术介绍
维生素，是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在人类成长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用，虽然它并不参与构成人体细胞，也不为人体提供能量，但是却是维持身体健康所必需的一类有机化合物。维生素A(VitaminA)又称视黄醇，是一类脂溶性维生素，其功能是维持动物的正常视觉功能，维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成，促进生长与生殖。一般可以从动物肝脏，奶制品或者蛋类中摄取，也可以摄入富含胡萝卜素的蔬菜水果，通过体内合成来的的维生素A维生素E(VitaminE)又称生育酚，也是一种脂溶性维生素,其功能是促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视眼发生和发展。人体内的维生素A和维生素E缺乏和过量都会导致不同的生理疾病，所以对体内两种维生素浓度的检测和监控就显得尤为重要。目前，在维生素检测领域当中，血清中维生素A和E的检测方法主要有液相色谱串联质谱法LC-MS/MS方法，免疫检测、HPLC-UV法等，其中，液相色谱串联质谱法即有色谱的分离方法又有质谱的特异性鉴定方法，在小分子物质测定中具有极大的优势，具有特异性强、准确度高、分析时间短等特点，被业界广泛用于血清中维生素A和E的测定。CN108107133A公开了一种“液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法”，包括以下步骤：1)通过样本制备液提取维生素A和维生素E，将提取后的样本取样进入色谱质谱系统，通过色谱柱的初步分离进入质谱中,定性检测维生素A和维生素E。2)采用同位素标记的视黄醇-d6和α-生育酚-d6作为内标，制备标准曲线。3)检测待测样本的信号强度代入标准曲线，得到维生素A和维生素E的定量值。然而这种技术方案当中：1、提取维生素A和维生素E的方法是需要静脉采血得到1mL左右的血清，但是对于儿童来说，特别是新生儿和来说静脉采血有一定的困难，进而使得该方法的实际应用存在局限。具体来说，当采用静脉采血的方式的时候，需要通过一次性采血针和真空采血管抽取一毫升以上的静脉血，采集位置多位于人体表的浅静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉，小儿常采颈外静脉血液(比较明显的血管)。在实际检测时，也需要往静脉血中添加分离胶得到上清液，随后用上清液进行检测，1毫升静脉血最多得到0.5毫升的上清液，因此在实际采血时也需要采集足够的血量以保证检测的进行。2、该技术方案虽然相较更以往的技术在液相色谱串联质谱检测步骤可以做到特异性的提高，但是其检测时间并无优化改良，从而导致检测效率依旧低下。3、该技术方案的前处理步骤中需要加入内标物，甲醇溶液，硫酸锌溶液，正己烷，氮气吹干后再加入复溶液，前处理步骤麻烦，使得检测效率低下。综上，目前维生素检测领域依旧需要一种高效的高通量的维生素A和维生素E的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，所述微量检测方法采用末梢采集微量血的方式获取极少数的血样本，即可高效高通量地检测维生素A和维生素E的含量，提高维生素的检测效率，并且末梢采血的方式特别适用于儿童，孕妇以及老人等人群的采血，降低婴幼儿静脉采血的不适感。本专利技术的目的在于提供一末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，所述微量检测方法采集检测者的末梢血即可，取血量小于0.5毫升即可，且末梢血不需要进行分离，提高检测效率。所述微量检测方法相较传统的液相色谱串联质谱方式进行了改良，检测样本的前处理步骤更加简单方便有效，串联质谱方法的效率高，能够在2分钟内完成维生素A和E的分析检测，满足临床检测的需求。本专利技术的目的在于提供一末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，所述微量检测方法中采用改良后的样本前处理步骤加上优化设置的串联质谱检测条件，实现高通量，高精度的维生素A和维生素E的定量检测和定性检测。为了实现以上任意专利技术目的，本专利技术提供一末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，包括以下步骤：S1:待测样本的前处理：取末梢血样品加入含有内标溶液，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心上清液，室温下氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后得到待测样本；以及S2:超高效液相色谱串联质谱检测：通过超高效液相色谱串联质谱检测获得所述待测样本中待测物的峰面积和对应内标峰面积。在一些实施例中，包括：S3:代入所述待测样本中待测物的峰面积与内标峰面积的比值到回归方程，得到待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与内标峰面积比值和标准溶液浓度之间的关系。在一些实施例中，所述步骤S2当中，流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：2mM甲酸铵与0.1％甲酸甲醇溶液，控制流速为0.5mL/min。在一些实施例中，梯度设置为：时间(min)流动性A(％)流动性B(％)0.012880.112880.52981.52981.5112882.01288在一些实施例中，离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-2.5KV；脱溶剂气流速：400-600℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar。在一些实施例中，所述内标溶液为含有用甲醇配置的d4-视黄醇的内标溶液和/或含有用甲醇配置的d6-α-视黄醇的内标溶液。在一些实施例中，所述复溶液为75-85％的甲醇溶液，所述d4-视黄醇的内标溶液的浓度为500-1000ng/mL，所述d6-α-视黄醇的内标溶液的浓度为8-12μg/mL，所述特丁基甲醚一次萃取。在一些实施例中，所述回归方程的制备包括以下步骤：A1:以甲醇配制维生素A和/或维生素E的标准品储备液，然后加入人造血清，制备不同浓度的维生素A标准品溶液和/或维生素E标准品溶液，低温保存备用；A2:所述标准品溶液作为步骤S1当中的样品，进行步骤S1和步骤S2的操作；A3：获取不同标准品和对应的内标峰面积，以所述标准品溶液的浓度为X轴，所述标准液峰面积和对应的内标峰面积的比值为Y轴，得到标准曲线，对所述标准曲线进行线性回归分析，经过“1/X”权重因子得到所述回归方程。在一些实施例中，所述维生素A标准品溶液的浓度控制在20-2000ng/ml，所述维生素E标准品溶液的浓度控制在在0.2-20μg/mL。在一些实施例中，所述血样品取自末梢血，体积量为30-60ul，所述超高效液相色谱串联质谱2分钟完成检测。附图说明图1是根据本专利技术的一实施例的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法在检测过程中显示的维生素A的MRM色谱图。图2是根据本专利技术的一实施例的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法在检测过程中显示的维生素E的MRM色谱图。图3是根据本专利技术的一实施例的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法在检测过程中显示的维生素A的定量标准工作曲线。图4是根据本专利技术的一实施例的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法在检测过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:待测样本的前处理：取末梢血样品加入含有内标溶液，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心上清液，室温下氮气吹干所述上清液，并加入复溶液涡旋震荡后，得到待测样本；以及S2:超高效液相色谱串联质谱检测：通过超高效液相色谱串联质谱检测获得所述待测样本中待测物的峰面积和对应内标峰面积。

【技术特征摘要】
1.末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:待测样本的前处理：取末梢血样品加入含有内标溶液，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心上清液，室温下氮气吹干所述上清液，并加入复溶液涡旋震荡后，得到待测样本；以及S2:超高效液相色谱串联质谱检测：通过超高效液相色谱串联质谱检测获得所述待测样本中待测物的峰面积和对应内标峰面积。2.根据权利要求1所述的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，包括：S3:代入所述待测样本中待测物的峰面积与内标峰面积的比值到回归方程，得到待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与内标峰面积比值和标准溶液浓度之间的关系。3.根据权利要求2所述的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，所述步骤S2当中，流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：2mM甲酸铵与0.1％甲酸甲醇溶液，控制流速为0.5mL/min。4.根据权利要求3所述的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，梯度设置为：时间(min)流动性A(％)流动性B(％)0.012880.112880.52981.52981.5112882.012885.根据权利要求4所述的末梢血中维生素A和维生素E的微量检测方法，其特征在于，离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-2.5KV；脱溶剂气流速：400-600℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，海云，陈亮，栾羽，张志栋，黄新良，徐可丰，李冰，罗示齐，王万强，黄曙，刘礼欢，周响响，应海媚，
申请(专利权)人：杭州度安医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33