一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法及应用，涉及生物技术领域。该方法包括步骤：采用药敏纸片扩散技术筛选出可抑制植物组织培养中细菌污染物的最适抗生素；采用药敏试验E‑test技术确定最适抗生素的最低抑制浓度；采用最低抑制浓度的最适抗生素抑制所述植物组织培养中细菌污染物。本发明专利技术首次将药敏纸片扩散和药敏试验E‑test技术应用于植物组织培养，并证实了该方法可快速有效选择出最适抗生素及最低抑制浓度，在对外植体损伤最小的情况下，通过最小抑制浓度的抗生素添加抑制细菌污染物；本发明专利技术方法不需要检测和鉴定细菌分离株，具有简单性、重现性和成本低等优点，可广泛应用以解决困扰植物组织培养的细菌污染问题。

【技术实现步骤摘要】
一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法及应用。
技术介绍
植物组织培养是在无菌和人工控制的环境条件下利用适当的培养基对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。是基础研究和应用研究的重要工具，也是商业应用的重要工具。植物组织培养已经是植物生物学的核心技术，对大规模繁殖、保护和遗传资源具有重要意义。目前，研究和商业植物组织培养实验室均受到细菌污染的困扰，植物组织培养的细菌污染物可能来自被感染的体外植株、组织培养操作技术不当或较差的实验环境等，且污染菌株可能是附生或内生细菌。附生细菌寄生于植物表面，可以用化学药剂逐步将其根除。相比之下，内生细菌位于植物的细胞间，利用简单的表面灭菌方法很难消除它们。植物组织培养内的内生微生物污染物往往会降低其生长、增殖和生根率，在某些情况下甚至会导致植物死亡。目前，植物内的内生细菌仍然是植物组织培养中存在的重要问题，通常用抗生素对其进行控制和消除。当细菌的性质未知时，广谱抗生素总是被应用。然而，没有选择正确的抗生素往往会导致效果甚微。此外，一般不推荐在培养基中长期使用单一抗生素，因为长期使用抗生素对植物组织有毒害作用，可能会对植株的生长产生负面影响。在以前的研究中，细菌通过传统的表型鉴定，通常需要几周的时间；近几年，许多学者通过扩增16SrDNA及它们的序列片段来对细菌进行鉴定，该方法已在多种植物物种中报道。但是，细菌的种类和数量众多，即使通过分子特性鉴定出细菌，仍然不能在短时间内选择最优的抗生素进行处理。专利技术内容有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法及应用，主要目的是解决处理效率低和准确性低的问题。为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法，所述方法包括以下步骤：采用药敏纸片扩散技术筛选出可抑制植物组织培养中细菌污染物的最适抗生素；采用药敏试验E-test技术确定所述最适抗生素的最低抑制浓度；采用所述最低抑制浓度的所述最适抗生素抑制所述植物组织培养中细菌污染物。作为优选，所述植物为樱桃组培苗。作为优选，所述最适抗生素为四环素、头孢噻肟、羧苄青霉素、卡那霉素或链霉素。作为优选，所述最适抗生素为四环素。作为优选，所述四环素的最低抑制浓度为0.5μgmL-1-1.0μgmL-1。作为优选，所述四环素的最低抑制浓度为1.0μgmL-1。另一方面，本专利技术实施例提供了一种纸片扩散法和抗生素浓度梯度法相结合的技术在抑制植物组织培养中细菌污染物中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术首次将纸片扩散技术和抗生素浓度梯度技术应用于植物组织培养，并且证实了该方法可快速有效选择出最适抗生素及最低抑制浓度，在对外植体损伤最小的情况下，通过最小抑制浓度的抗生素添加抑制细菌污染物；本专利技术方法不需要检测和鉴定细菌分离株，具有简单性、重现性和成本低等优点，可被广泛采用以解决困扰植物组织培养的细菌污染问题。附图说明图1是本专利技术实施例提供的纸片扩散法定性测定结果图；(A.卡那霉素，B.链霉素，C.氨苄青霉素，D.头孢噻肟，E.盘尼西林(青霉素)，F.头孢唑啉，G.四环素，H.羧苄青霉素)图2是本专利技术实施例提供的E-test法定量测定结果图；图3是本专利技术实施例提供的不同浓度抗生素处理条件下外植体生长及细菌抑制情况外观图；图4是本专利技术实施例提供的不同浓度抗生素处理条件下外植体第25天的分化情况外观图；图5是本专利技术实施例提供的叶绿素荧光Fv/Fm图；图6是本专利技术实施例提供的不同浓度抗生素处理条件下外植体叶绿素含量变化曲线图；图7是本专利技术实施例提供的不同浓度抗生素处理条件下SOD和POD活性变化曲线图；图8是本专利技术实施例提供的PSII最大量子效率Fv/Fm曲线图；(A.细菌污染对外植体Fv/Fm的影响；B.不同浓度的抗生素对外植体Fv/Fm的影响)图9是本专利技术实施例提供的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量变化曲线图；(A.细菌污染对外植体叶绿素a含量的影响；B.不同浓度的抗生素对外植体叶绿素a含量的影响；C.细菌污染对外植体叶绿素b含量的影响；D.不同浓度的抗生素对外植体叶绿素b含量的影响；E.细菌污染对外植体叶绿素总含量的影响)图10是本专利技术实施例提供的细菌污染对SOD和POD活性影响的曲线图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本专利技术申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。本专利技术中采用的专业术语解释如下：纸片扩散法：是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈，即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。E-test法(抗生素浓度梯度法-E试验)：E试条是一条无孔试剂载体，一面固定有预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的最低浓度。实施例植物材料和生长条件：待测菌株分离自樱桃砧木‘吉塞拉6号’外植体，该外植体由西北农林科技大学园艺学院樱桃课题组培育，外植体在添加植物激素0.5mgL-16-BA(6-苄氨基腺嘌呤)和0.1mgL-1IBA(吲哚丁酸)的MS培养基中培养，放置在植物组织培养间，光照强度2000lux，23±2℃，16h光照/8h黑暗。细菌污染物的接种：从外植体‘吉塞拉6号’中分离出的细菌被直接接种于LB(lysogenybroth)培养基中，用于纸片扩散法和E-test试验；为了保证试验数据的一致性，在无菌固体MS培养基中加入了相同接种量的细菌污染物(1×108units/mL,100μL)；对生长一致的外植体进行修剪，并将其置于含相同量细菌污染物的固体培养基中，该组命名为“Bacteria组”，简称为“B组”。纸片扩散法(定性)：按照改良的纸片扩散法，在固体LB培养基上进行药敏试验，将细菌接种物(1×108units/mL,100μL)均匀地涂布于直径90mm的LB培养基表面，待平板表面风干后，将4个商用、固定浓度的药敏纸片(购于杭州微生物试剂有限公司)置于接种后的平板表面(如图1)；本实施例选取8种抗生素(卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、头孢噻肟、盘尼西林(青霉素)、头孢唑啉、四环素和羧苄青霉素)对该菌株进行测试；LB培养基置于28℃的培养箱中培养16-24h，每个抗生素纸片周围的抑菌圈可被测量至毫米，抑制圈的直径与抗生素通过琼脂培养基的分离率和扩散速率有关。E-test法(定量)：E-test法是一种可以确定抗生素最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)的扩散方法；E-test法操作步骤类似于纸片扩散试验，只是用E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用药敏纸片扩散技术筛选出可抑制植物组织培养中细菌污染物的最适抗生素；采用药敏试验E‑test技术确定所述最适抗生素的最低抑制浓度；采用所述最低抑制浓度的所述最适抗生素抑制所述植物组织培养中细菌污染物。

【技术特征摘要】
1.一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用药敏纸片扩散技术筛选出可抑制植物组织培养中细菌污染物的最适抗生素；采用药敏试验E-test技术确定所述最适抗生素的最低抑制浓度；采用所述最低抑制浓度的所述最适抗生素抑制所述植物组织培养中细菌污染物。2.如权利要求1所述的一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法，其特征在于，所述植物为樱桃组培苗。3.如权利要求2所述的一种植物组织培养中细菌污染物的抑制方法，其特征在于，所述最适抗生素为四环素、头孢噻肟、...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇良，梁成林，宛甜，刘涛，武仁敦，韩钰，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61