一种基于LAMP快速检测苹果轮纹病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种苹果轮纹病菌LAMP检测引物及其应用。一种基于LAMP技术检测苹果轮纹病菌的引物组合物由6条特异性引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB组成。本发明专利技术还提供了一种苹果轮纹病菌LAMP检测方法,包括以下步骤:1)提取待测样品DNA;2)使用本发明专利技术提供的引物组合物对待测样品DNA进行环介导等温扩增;3)结果检测,显色结果观察到绿色荧光或电泳出现梯形条带的判断为阳性,显色橙色或橘黄色或没出现梯形条带的判断为阴性。本发明专利技术为苹果轮纹病菌提供了新的分子检测方法及引物组合物,能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到苹果轮纹病菌,为苹果轮纹病菌的早期诊断、检测及进出口快速检测提供可靠的技术和理论依据。

A rapid detection method for apple ring rot pathogen based on LAMP

The invention discloses a LAMP detection primer for apple ring rot and its application. A primer combination based on LAMP technology for detection of apple ring rot pathogen is composed of six specific primers F3, B3, FIP, BIP, LF and LB. The invention also provides a method for LAMP detection of apple ring rot pathogen, which includes the following steps: 1) extracting DNA of the sample to be tested; 2) using the primer composition provided by the invention to treat the DNA of the sample to be tested for loop-mediated isothermal amplification; 3) detecting the result, the judgement that green fluorescence or trapezoidal band appears in electrophoresis is positive, and the judgement that the color is orange. Oranges or trapezoidal bands are not judged to be negative. The invention provides a new molecular detection method and a primer composition for apple ring rot pathogen, which can detect apple ring rot pathogen quickly, conveniently, efficiently, with high specificity and sensitivity, and provides reliable technical and theoretical basis for early diagnosis, detection and rapid detection of import and export of apple ring rot pathogen.

【技术实现步骤摘要】
一种基于LAMP快速检测苹果轮纹病菌的方法
本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
,具体涉及一种苹果轮纹病菌LAMP检测引物及其应用。可用于苹果轮纹病菌快速、灵敏和特异的分子检测,同时可用于苹果轮纹病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
技术介绍
苹果(Malussieversii(Led.)Roem.)果实营养丰富,含有丰富的锌，素有“智慧果”、“记忆果”的美称，苹果中还含有丰富的蛋白质、多酚、维生素C等营养物质。不仅如此，苹果气味芬芳，口感香甜是深受广大生产者和消费者喜爱的高经济价值作物。苹果轮纹病（Botryosphaeriadothidea）在苹果的高产优质栽培中成为制约产业发展的重要因子，近年来随着易感品种富士苹果的大面积种植，苹果轮纹病发病率逐年升高，危害面积不断扩大，已成为中国苹果生产中的重要病害，严重威胁苹果产业的可持续发展。轮纹病菌主要危害枝干和果实，当侵染枝干后病菌在皮层组织内迅速扩展，造成主干大枝树皮粗糙，形成"粗皮病"，削弱树势。果实受害产生深浅相间的同心轮纹状病斑，其外缘有明显的水渍圈，果实酸臭腐烂，从而导致苹果降低品质失去商品价值。然而,针对此病尚无较好的抗病品种且轮纹病菌的潜伏期较长，早期难以通过肉眼观察症状被发现，因此,快速、准确地在发病前或初期对病菌的侵染动态进行监测,及时采取有效的防治方法对控制病害在田间和储运中的发生,以及进出口苹果的快速检测中具有十分重要的意义。传统轮纹病菌的分类与鉴定主要基于形态学特征及致病性测定等,这种鉴定方法耗时较长、程序繁琐、灵敏度低以及经验性强,从发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间,难以做到对病害发生及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。随着分子生物学技术的不断发展,应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多,但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处。如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力,常常受到抗血清质量的影响,且可能存在交叉反应,特异性较差,容易造成假阳性;PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术,但这些PCR技术检测时间较长,需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备,不利于基层生产上推广应用,上述缺欠限制了这些先进方法的推广应用。环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术,该技术可在60℃-65℃恒温条件下,利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内就能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109-1010个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-timePCR仪及凝胶电泳仪进行检测,而且还可以通过SYBRGreenI、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后,肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济,且无需特殊设备,检测结果可由肉眼判断,极适合于在基层生产部门推广应用,因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测,在植物病原菌检测中报道较少,关于苹果轮纹病菌的LAMP检测国内外均未见报道。本专利技术基于环介导等温扩增（LAMP）技术原理,选取轮纹病菌ITS基因序列为检测靶标,在ITS基因序列的6个区域设计了6条苹果轮纹病菌特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,建立以SYBRGreenI为荧光显色指示剂的苹果轮纹病菌可视化LAMP检测技术。该技术操作简单、灵敏度和特异性高,且无需贵重仪器设备,适宜于田间苹果轮纹病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定,对苹果轮纹病进行及时有效的防治具有重要意义，同时为口岸等检疫部门提供简单易行的检测初筛手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对苹果轮纹病菌检测和鉴定主要基于形态学特征,方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低,难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题,以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器,且检测时间较长等问题,提供了一种苹果轮纹病菌LAMP技术检测方法及使用的引物组合物,本专利技术检测方法易于操作、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠为实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:1.苹果轮纹病菌LAMP检测引物:通过测定苹果轮纹病菌Botryosphaeriadothidea和其它苹果主要病菌例如苹果腐烂病菌、苹果炭疽病菌、苹果霉心病菌的ITS基因,对其ITS基因序列进行比对分析,筛选轮纹病菌与其他病菌同源性最低的序列进行LAMP引物设计，利用在线LAMP引物设计软件PrimersoftwareExplorerV5，网址为：http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html设计一套苹果轮纹病菌特异性LAMP引物,包括F3、B3、FIP、BIP、LF、LB6条引物,其序列为F3:5'-TGGGTGTTGGAGGGTGAT-3'B3:5'-TGGGAGGTGAAGGTTGAGAA-3'FIP:5'-GAGGGGGGAGGTGTTTGAGGTAGAAGGGTGAAGGTGTGGT-3'BIP:5'-GGGTGTTGGGTGAAGGGTAGTGTTGAGAAGGTTGGTGGGG-3'LF：5'-GGAGGGTGGGGAATAGGA-3'LB：5'-AGAAGATAGATGTGGGTTGGGAG-3'2.苹果轮纹病菌LAMP检测方法,包括以下步骤:(1)提取待测样品基因组DNA：用于检测病原菌纯培养物时,采用CTAB法进行提取基因组DNA,具体方法如下:取少量菌丝粉于1.5mL离心管中(菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜),加入900μL2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0;20mmol/LEDTA,pH8.0;1.4mol/LNaCl)和90μLSDS(十二烷基苯磺酸钠)【注:CTAB,SDS需60℃预热】,使用振荡器振荡混匀,60℃水浴20min(DNA释放至缓冲液中),12000r/min离心15min;取上清液700μL,加等体积酚、氯仿、异戊醇(25:24:1),轻轻振荡混匀,12000r/min离心10min取上清液500μL,加入等体积氯仿再抽提一次,12000r/min离心5min;取上清液350μL，加入1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀15min,12000r/min离心5min;弃去上清液,加入700μL冰70%乙醇进行洗涤(稍离心;倾掉上清液),在超净工作台上晾干至无酒精味,加入30-60μLTE(10mmol/LTris-HCl,0.1mmol/LEDTA,pH8.0)溶液进行溶解,得到DNA溶液,用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀稀释至100ng/μL待用；用于检测植物组织中存在苹果轮纹病菌时,采用NaOH快速裂解法提取DNA,具体过程如下:向每毫克植物组织中加入10μL0.5mol/LNaOH,在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中,12000r/min离心6m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.苹果轮纹病菌LAMP检测引物,其特征在于,其核苷酸序列为:F3: 5'‑ TGGGTGTTGGAGGGTGAT‑3'B3: 5'‑ TGGGAGGTGAAGGTTGAGAA‑3'FIP: 5'‑ GAGGGGGGAGGTGTTTGAGGTAGAAGGGTGAAGGTGTGGT‑3'BIP: 5'‑ GGGTGTTGGGTGAAGGGTAGTGTTGAGAAGGTTGGTGGGG‑3'LF：5'‑ GGAGGGTGGGGAATAGGA‑3'LB：5'‑ AGAAGATAGATGTGGGTTGGGAG‑3'。

【技术特征摘要】
1.苹果轮纹病菌LAMP检测引物,其特征在于,其核苷酸序列为:F3:5'-TGGGTGTTGGAGGGTGAT-3'B3:5'-TGGGAGGTGAAGGTTGAGAA-3'FIP:5'-GAGGGGGGAGGTGTTTGAGGTAGAAGGGTGAAGGTGTGGT-3'BIP:5'-GGGTGTTGGGTGAAGGGTAGTGTTGAGAAGGTTGGTGGGG-3'LF：5'-GGAGGGTGGGGAATAGGA-3'LB：5'-AGAAGATAGATGTGGGTTGGGAG-3'。2.一种利用权利要求1所述引物进行苹果轮纹病菌LAMP检测的方法,其特征在于,包括以下具体步骤:(1)提取待测样品基因组DNA；(2)LAMP反应体系的建立:LAMP检测反应体系为25μL,以步骤(1)提取的DNA为模板,反应体系包括10μMF3和B3各0.5μL,10μMFIP和BIP各2.0μL,10μMLF和LB各1.0μL，2XLAMPMasterMix反应混合液12.5μL,8UBstDNA聚合酶0.5μL,DNA模板1.0μL,用灭菌超纯水补足至25μL，然后在反应管盖子内加入显色剂SYBRGreenI1.0μL；(3)LAMP反应条件:65℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪少丽，王英姿，王培松，刘保友，栾炳辉，
申请(专利权)人：山东省烟台市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37