本发明专利技术公开了一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。该试剂盒包括铁皮石斛特异引物和特异探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示；石斛属通用引物和通用探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增可以对铁皮石斛及石斛属植物加以鉴别。本发明专利技术以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，为真正的铁皮石斛在中药市场的地位保驾护航。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用
本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用，属于分子生物学
技术介绍
铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)系兰科石斛属多年生草本植物，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，有味甘、质重、黏性大等特点。铁皮石斛在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，被誉为“中华九大仙草”之首，具有“养阴生津，润喉护嗓，温胃明目，补肾益力，延年益寿”的功效。现代的化学成分和药理研究表明：铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力和有效减轻肝损伤等作用。由于其极高的药用价值，导致市场价格也随之攀升；另一方面铁皮石斛经过加工成干品之后，几乎无法从外观上辨别真伪；但在选购过程中混杂，特别容易使消费者成为“冤大头”。因此，辨别铁皮石斛的真伪，建立系统、准确、有效的中药铁皮石斛鉴定方法显得尤为重要，这样既可以让消费者买到质量有保障的产品，也可以提高消费者对铁皮石斛的认知，可谓一举二得。目前常用的药材鉴定方法有组织鉴定、显微鉴定、光谱鉴定、色谱鉴定、分子生物学技术鉴定等，但是这些方法会存在感官检测局限性、准确性低、仪器配套成本高、鉴别操作复杂等问题。近年来实时荧光PCR技术检测的灵敏度、特异性和准确性，受到了很多研究领域的一致认可。本专利技术将该技术应用于铁皮石斛的真伪鉴定中，为市场上真正有品质、有疗效的铁皮石斛中药材保驾护航。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。本专利技术的试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，它包括铁皮石斛特异引物和特异探针，石斛属通用引物和通用探针，其中，铁皮石斛特异上游引物TPF：5’-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-3’(SEQIDNO.1)；铁皮石斛特异下游引物TPR：5’-AGGCCTATGCTATTGTGATAAGCG-3’(SEQIDNO.2)；铁皮石斛特异探针TPP：5’-X1-TATTGTGATAAGCGCGCCCG–Y1-3’(SEQIDNO.3)；石斛属通用上游引物USHF：5’-GGCAATGGATATCTCGGCTC-3’(SEQIDNO.4)；石斛属通用下游引物USHR：5’-CAACTTGCGTTCAAAGACTCG-3’(SEQIDNO.5)；石斛属通用探针USHP：5’-X2-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-Y2-3’(SEQIDNO.6)。铁皮石斛特异探针TPP和石斛属通用探针USHP，探针序列的5’端修饰有报告基团X1/X2，3’端修饰有淬灭基团Y1/Y2，所述报告基团可以为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团可以为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。优选的，铁皮石斛特异探针TPP：5’-FAM-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-BHQ1-3’；优选的，石斛属通用探针USHP：5’-ROX-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-BHQ2-3’。进一步的，本专利技术的荧光PCR检测试剂盒，其中各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。进一步的，本专利技术的荧光PCR检测试剂盒，它还包括：2×TaqManMasterMix、DNA模板和双蒸水。进一步优选的，上述的荧光PCR检测试剂盒，其20μLPCR扩增体系为：2×TaqManMasterMix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL，其配制方法如表1所示。表1PCR反应扩增体系试剂名称工作浓度用量(μL)终浓度TaqManMasterMix2×101×USHF/USHR引物对2～10μM10.1～0.5μMTPF/TPR引物对2～10μM10.1～0.5μMTPP探针1～5μM10.05～0.25μMUSHP探针1～5μM10.05～0.25μMDNA模板0.5～50ng/μL21～100ng双蒸水4总体积20进一步的，上述的荧光PCR检测试剂盒，还包括铁皮石斛阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。本专利技术还提供了一种用于鉴别铁皮石斛真伪的检测方法，其特征是，具体步骤如下：1)提取待测样本的模板DNA；2)PCR扩增使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增，需要在4通道或4通道以上的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整；3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否为铁皮石斛及是否属于石斛属植物。进一步的，如果FAM、ROX荧光修饰探针均有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为铁皮石斛；如果只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属非铁皮石斛植物；如果FAM、ROX荧光修饰探针都没有扩增曲线时，则不是石斛属植物。本专利技术的有益效果：与现有的技术相比：本专利技术以石斛的一对通用引物和铁皮石斛的一对特异引物对待测样本DNA提取物进行PCR扩增，以铁皮石斛的特异性荧光探针及石斛属通用探针，以2色荧光对铁皮石斛及石斛属植物加以鉴别。本专利技术以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，为真正的铁皮石斛在中药市场的地位保驾护航。附图说明图1为铁皮石斛在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当FAM、Rox荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为铁皮石斛；图2为石斛属非铁皮石斛植物在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属非铁皮石斛植物；图3为铁皮石斛模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng、0.0032ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.016ng。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。本专利技术中所用实验材料、试剂与仪器如下：实验材料：铁皮石斛、黄橙石斛、密花石斛、铜皮石斛、紫皮石斛、竹枝石斛、石豆石斛、霍山米斛、翅梗石斛、天宫石斛、玫瑰石斛、竹叶石斛、金钗石斛、喉红石斛、鼓槌石斛、蝴蝶兰(黄花)、蝴蝶兰(红花)、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡、平贝母、白术、人参。所用试剂：植物DNA提取试剂盒，DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，它包括铁皮石斛特异引物和特异探针，石斛属通用引物和通用探针，其中，铁皮石斛特异上游引物TPF：5’‑TATTGTGATAAGCGCGCCCG‑3’；铁皮石斛特异下游引物TPR：5’‑AGGCCTATGCTATTGTGATAAGCG‑3’；铁皮石斛特异探针TPP：5’‑X1‑TATTGTGATAAGCGCGCCCG–Y1‑3’；石斛属通用上游引物USHF：5’‑GGCAATGGATATCTCGGCTC‑3’；石斛属通用下游引物USHR：5’‑CAACTTGCGTTCAAAGACTCG‑3’；石斛属通用探针USHP：5’‑X2‑TGGTGCGAATTGCAGAATCCC‑Y2‑3’；其中X1和X2为报告基团，Y1和Y2为淬灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，它包括铁皮石斛特异引物和特异探针，石斛属通用引物和通用探针，其中，铁皮石斛特异上游引物TPF：5’-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-3’；铁皮石斛特异下游引物TPR：5’-AGGCCTATGCTATTGTGATAAGCG-3’；铁皮石斛特异探针TPP：5’-X1-TATTGTGATAAGCGCGCCCG–Y1-3’；石斛属通用上游引物USHF：5’-GGCAATGGATATCTCGGCTC-3’；石斛属通用下游引物USHR：5’-CAACTTGCGTTCAAAGACTCG-3’；石斛属通用探针USHP：5’-X2-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-Y2-3’；其中X1和X2为报告基团，Y1和Y2为淬灭基团。2.如权利要求1所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述报告基团X1和X2为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团Y1和Y2为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。3.如权利要求2所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述铁皮石斛特异探针TPP：5’-FAM-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-BHQ1-3’；所述石斛属通用探针USHP：5’-ROX-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-BHQ2-3’。4.如权利要求3所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。5.如权利要求3所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述荧光...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪燕，张全芳，刘艳艳，范阳阳，谭晴晴，胡悦，刘国霞，步迅，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37
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