与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用。该分子标记为5’‑TAGAAGACTGGA‑3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置，其InDel分子标记引物如SEQ ID NO.1‑2所示。采用该InDel分子标记引物即可通过简单的PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳等操作有效鉴定材料中恢复基因的存在与否及是否纯合，从而加快了田间棉花细胞质雄性不育新恢复系材料的选育，并保证了棉花恢复系的种子纯度。

【技术实现步骤摘要】
与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用。
技术介绍
棉花是我国重要的经济作物，在农业生产中具有重要的地位和意义。杂种优势的研究和利用可以有效地提高棉花产量和抗逆性。杂交制种是当前杂种优势利用的主要体现，棉花杂种一代表现出显著的杂种优势，比常规品种增产15％左右。在实际生产中，棉花可以通过人工去雄授粉法、化学杀雄法和“三系配套”法等方法生产杂交种。人工去雄授粉法费时费力成本较高，所获得的杂交种纯度也普遍偏低；化学杀雄法虽在杂交种制种过程中可免去人工去雄的繁杂，但易造成环境污染，存在稳定性不高等缺陷；“三系配套”法主要是以细胞质雄性不育系为主，在制种过程中可免除人工去雄法以及化学杀雄法费时费力、制种纯度偏低以及易造成环境污染等缺陷，适合大面积制种，可以很好地满足实际生产的需要。含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质(CMS-D2)的陆地棉不育系和含有恢复基因的恢复系是棉花杂种优势利用中主要的三系配套系统之一。目前，三系杂交种(以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主)的审定已经取得了一定进展，但棉花中由于恢复基因来源狭窄及恢复能力限制，且恢复基因的克隆和育性恢复的相关机理尚不清楚，使得优良恢复系亲本资源匮乏，造成强优势三系杂交组合的选育过程较为缓慢。因此，在三系杂交棉选育过程中，强恢复力的优良恢复系亲本的选育和改良是育种工作中长期面临的重点和难点。目前，在对优良恢复系的选育和改良方面，育种家通常可以采用常规的杂交选育技术达到这一目的，但其缺陷是育种周期长，占地面积大，每年都需要大量田间试验来确保含恢复基因材料的存在，费时费力，而且育种效率较低。另一方面，在三系杂交种制种过程中，需要恢复系与不育系杂交来得到杂交种。因此，保证恢复系的纯度至关重要，一旦混杂，将会造成杂交种出现不育的后果，影响棉花产量。因此，急需一种准确高效又快速的分子标记，利用分子标记辅助选择育种技术，能够解决常规育种过程中田间鉴定所需时间长、消耗大、准确性差等缺点，提高鉴定含恢复基因材料的效率，且保证恢复系种子的纯度，从而加速育种进程，满足实际生产需要。
技术实现思路
为了解决采用常规育种方法，恢复系材料选育和改良过程中田间材料鉴定费时费力、准确性差等缺点，提高鉴定含恢复基因材料的效率，并且在制种过程中保证恢复系种子纯度，本专利技术提供了一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及InDel分子标记引物，从而可以加快棉花恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。本专利技术提供的一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，其特征是，其核苷酸序列为5’-TAGAAGACTGGA-3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置，在恢复系中存在这一插入序列，在不含恢复基因的材料中，不存在这一插入序列。本专利技术还提供了一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记引物，其特征是，其上游引物为：5’-ATAAATGAATCAGTCAAGACATTTG-3’(SEQIDNO.1)；下游引物为：5’-AAAGTGAAGAGGAAAATTTGATGTT-3’(SEQIDNO.2)。本专利技术还提供了上述的InDel分子标记引物在棉花细胞质雄性不育恢复系选育以及在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。本专利技术还提供了一种采用上述的InDel分子标记引物鉴定哈克尼西棉雄性不育恢复系基因的方法，其特征是：1)采用上述的InDel分子标记引物对待测棉花样品的基因组DNA进行PCR扩增；2)对PCR扩增产物进行电泳分析；如果PCR产物同时扩增出片段长度为206bp和194bp的两条条带，则为恢复基因杂和的材料；如果PCR产物只扩增出片段长度为206bp的条带，则为恢复基因纯和的恢复系材料；如果PCR产物只扩增出片段长度为194bp的条带，则为不含恢复基因的材料。利用该InDel分子标记转化InDel分子标记引物，即可通过简单的PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳等操作，加快田间棉花细胞质雄性不育新恢复系材料的选育，保证棉花恢复系种子纯度，成功地将分子标记辅助选择育种技术应用于棉花新恢复系选育和三系杂交种的制种工作中。通过以上方法，在棉花细胞质雄性不育新恢复系材料的选育和改良工作中，可以显著降低田间材料鉴定的工作量，同时更好的保证新恢复系材料和棉花恢复系种子的纯度，加快育种进程，极大地提高育种效率和保证三系杂交种种子纯度，提高棉花产量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1)准确率高：InDel标记具有简单可靠、可重复、易辨别等优点，只需要经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。本专利技术利用一对InDel标记引物，能够从分子水平上区分出恢复系材料及三系杂交种，且不受环境因素的影响，提高了鉴别的准确性。2)操作简单，鉴定快速：InDel标记对棉花新恢复系材料的选育和保证三系杂交种种子纯度方面具有重要作用。与常规育种相比，InDel标记省去了大量人力、物力，在新恢复系材料选育和三系杂交种制种过程中，不需要投入大量精力于田间形状调查，省去了大量的测交等田间试验，只需要提取棉花DNA后，用InDel引物扩增后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳即可进行鉴定，整个检测的过程仅需要约2.5小时左右，时间短，效率高。此外，还可利用该InDel标记通过共显性带型有效鉴定材料中恢复基因的存在与否及是否纯合，从而极大加快新恢复系材料的选育。3)简单实用：与SSR标记和CAPS标记相比，InDel标记具有共显性好、重复性好和多态性丰富等特点之外，以InDel标记进行PCR扩增时，非特异性条带较少。本专利技术的InDel分子标记在新恢复系材料选育及恢复系种子纯度鉴定过程中，操作简单，共显性好、多态性丰富，具有良好的应用前景。附图说明图1为：含哈克尼西棉不育胞质的三系材料中Gh_D05G3392基因的启动子序列及参考基因组的序列比对结果，其中白色显示的“TAGAAGACTGGA”为目标序列；其中TM-1为陆地棉参考基因组序列；P92_A、P92_B和P92_R分别为不育系、保持系和恢复系材料中Gh_D05G3392基因的部分启动子序列；图2为：InDel标记对48份恢复基因近等基因系材料的鉴定结果，其中M：marker(TIANGEN公司50bpDNAladder)；1-24为不含恢复基因的近等基因系材料(A泳道)；25-48(33除外)为恢复基因位点杂和的近等基因系材料(R)，33为恢复基因纯和的材料；图3为：InDel标记对48份恢复基因回交群体材料(BC5F2)的鉴定结果，其中M：marker(TIANGEN公司50bpDNAladder)；其中a泳道为不含恢复基因单株；b泳道为恢复基因位点杂合单株；c泳道为恢复基因位点纯合单株。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。实施例1：我们发现陆地棉基因组Gh_D05号染色体上基因名称为Gh_D05G3392的基因的启动子区域存在InDel序列，该InDel序列位于该基因的启动子区域距起始密码子1247bp的位置，与恢复哈克尼西棉细胞质雄性不育性状的恢复基因连锁。在含恢复基因的材料中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，其特征是，其核苷酸序列为5’‑TAGAAGACTGGA‑3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置。

【技术特征摘要】
1.一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记，其特征是，其核苷酸序列为5’-TAGAAGACTGGA-3’，它位于恢复系基因Gh_D05G3392的启动子区域距起始密码子1247bp的位置。2.一种与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记引物，其特征是，其上游引物为：5’-ATAAATGAATCAGTCAAGACATTTG-3’；下游引物为：5’-AAAGTGAAGAGGAAAATTTGATGTT-3’。3.权利要求2所述的InDel分子标记引物在棉花细胞质雄性不育恢复系选育中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兵兵，吴建勇，邢朝柱，郭立平，戚廷香，张学贤，王海林，唐会妮，乔秀琴，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41