一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用，多肽制备方法为：1、六棱菊种子酶解，酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液浓缩、冻干，得多肽冻干粉；2、用DA201‑C型大孔树脂对多肽冻干粉初步分离纯化，依次用30％、45％、60％、75％乙醇梯度洗脱，各梯度洗脱4BV，收集各梯度洗脱液，浓缩、冷冻干燥得F30、F60、F75粗品；3、凝胶过滤色谱纯化：根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的流份，冷冻干燥，分别得多肽F30、F60、F75。本发明专利技术多肽可显著提高骨髓间充质干细胞增殖率，可用于骨髓间充质干细胞快速扩增。

A polypeptide and its application in promoting the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

The invention discloses a polypeptide and its application in promoting the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. The preparation method of the polypeptide is as follows: 1. Hexagonum seed is enzymatically hydrolyzed, the enzymatic hydrolysate is put into a dialysis bag with a molecular weight of 7000Da for dialysis, and the dialysis bag with a molecular weight less than 7000Da is concentrated and lyophilized to obtain polypeptide lyophilized powder; The separation and purification of peptide lyophilized powder with DA201 C type macroporous resin were carried out by gradient elution with 30%, 45%, 60% and 75% ethanol. Gradient elution of 4BV was carried out. Gradient eluent was collected, concentrated, freeze-dried and crude F30, F60 and F75 were obtained. 3, gel filtration chromatography was purified: the absorbance was collected from the sample solution according to chromatogram. The highest flow peaks corresponding to the chromatographic peaks were obtained by freeze drying, and the peptides F30, F60 and F75 were obtained respectively. The polypeptide of the invention can significantly improve the proliferation rate of bone marrow mesenchymal stem cells and can be used for rapid expansion of bone marrow mesenchymal stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
技术介绍
骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)已成为21世纪生命科学研究的重点，它是一类由Friedenstein等最先发现的成纤维样细胞，能够自我增殖和多向分化。BMSCs是一个有广阔前景的研究领域，有望被用在细胞疗法治疗中，这些都归功于其特殊能力，包括自身增殖能力强、分化范围广，能够修复损伤的功能组织及免疫调节等功能，不像人类胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题。此外，因为它们具有归巢性，所以可能作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。目前，BMSCs已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果，包括骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损伤、脊髓损伤等方面都有突破。因为BMSCs在基础研究及临床应用方面均具有巨大潜能，所以对于其培养增殖仍然需要更进一步研究，以便可以更为高效地获取利用这种细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。本专利技术通过如下技术方案实现：技术方案一：一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。步骤2、大孔树脂初步分离纯化采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用30％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉洗脱4BV，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F30粗品。步骤3、凝胶过滤色谱纯化将F30粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F30。优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。技术方案二：一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。步骤2、大孔树脂初步分离纯化采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4BV，收集60％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F60粗品。步骤3、凝胶过滤色谱纯化将F60粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F60。优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。技术方案三：一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。步骤2、大孔树脂初步分离纯化采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％、75％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4BV，收集75％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F75粗品。步骤3、凝胶过滤色谱纯化将F75粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，其特征在于，通过如下步骤制备而成：步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。步骤2、大孔树脂初步分离纯化采用DA201‑C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用30％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉洗脱4BV，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F30粗品。步骤3、凝胶过滤色谱纯化将F30粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G‑15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F30。...

【技术特征摘要】
1.一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，其特征在于，通过如下步骤制备而成：步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。步骤2、大孔树脂初步分离纯化采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用3...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢崇林，
申请(专利权)人：谢崇林，
类型：发明
国别省市：江苏,32