乙酰化戊型肝炎病毒衣壳蛋白ORF2及其用途制造技术

本发明专利技术涉及乙酰化戊型肝炎病毒ORF2蛋白、和增加该乙酰化ORF2蛋白生产的方法和细胞培养物。本发明专利技术还涉及该乙酰化ORF2蛋白用于促进ORF2多聚化和/或病毒样颗粒组装的用途。

Acetylated hepatitis E virus capsid protein ORF2 and its uses

The present invention relates to acetylated hepatitis E virus ORF2 protein, a method for increasing the production of the acetylated ORF2 protein and a cell culture. The invention also relates to the use of the acetylated ORF2 protein for promoting the polymerization of ORF2 and/or the assembly of virus-like particles.

【技术实现步骤摘要】
乙酰化戊型肝炎病毒衣壳蛋白ORF2及其用途
本专利技术涉及分子生物学和病毒学领域。具体地，本专利技术涉及乙酰化戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)衣壳蛋白ORF2，和调节戊型肝炎病毒ORF2多肽的乙酰化水平的方法。本专利技术还涉及HDAC6的抑制剂在改善ORF2多肽稳定性、HEV病毒形成、HEV病毒复制和HEV病毒样颗粒形成中的用途。本专利技术也涉及通过改变细胞中HEVORF2的乙酰化水平来治疗HEV病毒感染的方法。
技术介绍
戊型肝炎病毒(HEV)在全球范围内感染人和动物，引起肠道传播的病毒性肝炎，在孕妇中致死率达到25％。1989年报道了来自肠道传播的非A非B肝炎患者的戊型肝炎病毒序列，该序列类似于从猪、兔、大鼠、鹿和野猪中分离的序列。HEV的衣壳蛋白ORF2是该病毒的主要抗原，特异性结合HEV基因组RNA的5’末端，在病毒感染及组装和病毒基因组完整性的维持上具有重要作用。然而，对于HEV感染细胞中ORF2多肽稳定性和病毒包涵体(IB)形成的调节，目前所知甚少。戊型肝炎病毒(HEV)，作为无包膜病毒，含有7.2kb单股正链RNA，其编码三种蛋白ORF1，ORF2和ORF3(1)。现存在四种主要的HEV基因型，每年在全球引起大约2000万人感染，包括3.3百万症状性戊型肝炎病例和56600戊型肝炎引起的死亡(2,3)。1和2基因型HEV主要感染人并在发展中国家造成流行性爆发，基因型3和4在发展中和发达国家中具有人畜共患性。ORF2是HEV的主要抗原，包含660个氨基酸残基，在病毒感染中起主要作用，可诱导宿主免疫应答(5)。截短的ORF2(aa112-660)片段能够自组装成病毒样颗粒(VLP)(6)。ORF2VLP可与天然病毒诱导相同免疫原性途径，已经在研究和疫苗生产中用于模拟HEV(7,8)。同时，HEVORF2也能够结合HEV基因组RNA的5’末端，在病毒组装和基因组完整性的维持上起作用(9)。ORF2的N端信号序列在内质网(ER)中共翻译，并在ER中实现N-连接糖基化修饰(10)。此外，ORF2的C端52个氨基酸残基也参与HEV包装和衣壳颗粒的稳定化(11)。尽管ORF2在HEV生命周期中非常重要，但是其在宿主中如何被调节仍未明。赖氨酸乙酰化是一种重要的翻译后修饰(PTM)，由赖氨酸乙酰转移酶动态催化，并由赖氨酸去乙酰化酶去除。赖氨酸的乙酰化涉及病毒生命周期的多种关键事件，包括染色质重塑、基因表达和蛋白质稳定性调节，细胞内运输和病毒的裂解-潜伏转化(13)。HDAC6是IIb类HDAC酶家族成员，对例如α-微管蛋白,HSP90和p300等非组蛋白进行去乙酰化(14-17)。HDAC6在调节细胞形态、粘着和迁移、错误折叠蛋白的降解和应激反应、肿瘤细胞侵袭、血管发生、以及药物抗性中有重要作用(18-30)。近来的研究显示，HDAC6也在病毒感染和发病机理中起重要作用(13)。然而，HDAC6似乎具有双重作用(13)。一方面，HDAC6参与抗病毒感染的宿主防御(31-35)。另一方面，HDAC6被病毒利用，帮助病毒进入宿主细胞或病毒RNA合成(36-38)。迄今为止，病毒中仅HIV-1Tat蛋白已经鉴定为HDAC6底物(35)。考虑到目前戊型肝炎对人类健康的严重危害且近年来发病率呈迅速上升趋势，因此，目前仍需要改善HEV病毒疫苗生产和治疗HEV病毒感染的新方法。经过深入的研究，本专利技术人发现，HEV利用宿主的翻译后修饰系统来维持HEV衣壳蛋白ORF2稳定性和包涵体(IB)形成的新机制。基于此发现，本专利技术人提出了通过靶向调节宿主细胞中ORF2的乙酰化水平来改善HEV疫苗生产和治疗HEV感染的新方法和新组合物。专利技术概述因此，在一方面，本专利技术提供了一种改善HEV病毒、病毒样颗粒(VLP)或衣壳蛋白ORF2生产的方法和细胞培养系统，包括在生产细胞中调节HEV衣壳蛋白ORF2的K411位乙酰化水平。在一个实施方案中，生产HEV病毒。在进一步实施方案中，生产细胞是能够用于HEV病毒体外培养和生产的哺乳动物细胞，优选地A549细胞和PLC/PRF/5细胞。在进一步的实施方案中，所述方法包括步骤：用HEV病毒感染所述细胞。在另一实施方案中，生产HEV病毒样颗粒(VLP)或ORF2多肽。在进一步的实施方案中，生产细胞是包含ORF2编码核酸的细胞，例如哺乳动物细胞(包括但不限于HeLa细胞和293T细胞)、昆虫细胞(包括但不限于sf9细胞)。在本专利技术的此方面，优选地，调节ORF2乙酰化水平是增强ORF2乙酰化水平。在一个实施方案中，调节ORF2乙酰化水平通过抑制细胞中HDAC6表达和/或活性来实现。在进一步实施方案中，使用HDAC6RNAi分子(如siRNA)敲低细胞中HDAC6表达水平。在进一步实施方案中，使用HDAC6化学抑制剂，降低细胞中HDAC6活性。在另一实施方案中，通过调节ORF2的K411位乙酰化水平，增加细胞中ORF2的稳定性，和/或增加细胞中ORF2的量，尤其是ORF2多聚体的量。在另一实施方案中，通过调节ORF2的K411位乙酰化水平，增加细胞中病毒的复制。在另一实施方案中，通过调节ORF2的K411位乙酰化水平，增加细胞中VLP的组装和/或VLP产量。在另一方面，本专利技术也提供了分离的K411乙酰化HEVORF2多肽。所述ORF2多肽包含HEV基因型1-4野生型ORF2序列，或其同源物或变体。在再一方面中，本专利技术提供增加K411乙酰化HEVORF2多肽生产的方法和细胞培养物，其特征在于，抑制细胞中HDAC6的表达和/或活性，其中相对于未抑制HDAC6表达和/或活性的对照细胞，K411乙酰化ORF2多肽在细胞中的产量增加。在一个实施方案中，所述细胞是HDAC6敲低的细胞。在另一个实施方案中，向细胞使用HDAC6化学抑制剂。在一个实施方案中，本专利技术的方法还包括：收集产生的乙酰化HEVORF2多肽或该K411乙酰化HEVORF2多肽与未乙酰化ORF2的混合物，用于制备免疫组合物或疫苗或HEV病毒样颗粒。在一个实施方案中，本专利技术也提供了该乙酰化HEVORF2多肽用于促进ORF2多聚化和/或病毒或病毒样颗粒形成的用途。在再一方面，本专利技术提供了治疗HEV感染的方法，包括向感染HEV的个体施用HEVORF2多肽K411乙酰化调节剂。在一个实施方案中，所述调节剂降低ORF2多肽K411的乙酰化水平。在进一步的实施方案中，所述调节剂增加细胞中HDAC6的表达和/活性。在进一步实施方案中，所述调节剂是HDAC6表达核酸。附图简述图1:HEV衣壳蛋白ORF2在保守残基K411位的乙酰化。(A)表达GFP-1-ORF2(112-660)或GFP-4-ORF2(112-660)的293T细胞用GFP抗体免疫沉淀，并通过考马斯蓝染色。(B-D)质谱鉴定K411位置的乙酰化。通过质谱分析了293T细胞中表达的GFP-1-ORF2(112-660)(图C)和GFP-4-ORF2(112-660)蛋白(图D)。EPTVK411LYTSVEN肽在不同HEV基因型之间是保守的(图1B)。(E)在293T细胞中通过免疫印迹确定GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2的乙酰化。通过抗GFP抗体免疫沉淀在293T细胞中过表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的乙酰化戊型肝炎病毒开放阅读框2(HEV ORF2)多肽，其特征在于包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN，并在K411位具有乙酰化，其中所述多肽包含选自以下的序列：(a)野生型HEV病毒ORF2蛋白的全长序列，优选基因型1‑4，更优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN且包含全长ORF2序列的至少aa125至aa601区域，优选地由氨基酸aa112至aa660区域组成；(c)(a)或(b)的同源物或变体。

【技术特征摘要】
1.一种分离的乙酰化戊型肝炎病毒开放阅读框2(HEVORF2)多肽，其特征在于包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN，并在K411位具有乙酰化，其中所述多肽包含选自以下的序列：(a)野生型HEV病毒ORF2蛋白的全长序列，优选基因型1-4，更优选基因型1和4的HEVORF2蛋白的全长序列；(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN且包含全长ORF2序列的至少aa125至aa601区域，优选地由氨基酸aa112至aa660区域组成；(c)(a)或(b)的同源物或变体。2.权利要求1的分离的乙酰化ORF2多肽，其中所述多肽包含选自SEQIDNO:1-4的序列。3.一种增加权利要求1或2的乙酰化HEVORF2多肽产生的方法，包括：-提供包含抑制HDAC6表达的核酸分子的HDAC6敲低细胞，-用HEV病毒感染所述细胞，或向所述细胞中引入表达所述ORF2多肽的重组表达构建体，-培养细胞以产生所述乙酰化HEVORF2多肽，其中，相对于HDAC6表达未被敲低的对照细胞，K411乙酰化ORF2多肽在细胞中的产量增加。4.权利要求3的方法，其中，步骤(a)的细胞包含抑制HDAC6表达的siRNA或shRNA或其表达构建体，优选地所述细胞是HDAC6组成型敲低细胞或HDAC6条件性敲低细胞。5.一种增加权利要求1或2的乙酰化HEVORF2多肽产生的方法，包括：-用HEV病毒感染细胞，或向细胞引入表达所述ORF2多肽的重组表达构建体，-向所述细胞施加HDAC6化学抑制剂以抑制HDAC6活性，-培养细胞以生产所述乙酰化ORF2多肽，其中相对于HDAC6活性未被抑制的对照细胞，K411乙酰化ORF2多肽在细胞中的产量增加。6.权利要求5的方法，其中HDAC6化学抑制剂选自：非选择性抑制剂如TSA、Vorinost...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佑春，许楠，黄维金，赵晨燕，张黎，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11