高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法技术

本发明专利技术公布一高通量测定血清中25‑羟基维生素D的定量检测方法，包括以下步骤：待测样本的前处理：取样品加入含有25‑羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后离心得到待测样本；超高效液相色谱‑串联质谱检测所述待测样本，获得所述待测样本的内标峰以及对应内标峰面积；以及代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值到回归方程，得到待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。

Quantitative determination of 25- hydroxyvitamin D in serum by high throughput method

The invention discloses a high throughput quantitative detection method for determining 25 hydroxyvitamin D in serum, which includes the following steps: pretreatment of the sample to be measured: adding an internal standard containing 25 hydroxyvitamin D isotope to the sample, completing protein precipitation by eddy oscillation, adding the eddy oscillation extraction of terbutyl methyl ether, and centrifuging to obtain supernatant. The supernatant is dried by liquid and nitrogen gas, and a compound solution is added to the supernatant to centrifuge the sample after swirl oscillation; the sample is detected by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to obtain the internal standard peak and corresponding internal standard peak area of the sample to be measured; and the peak area and corresponding internal standard peak area substituted for the sample to be measured. The regression equation reflects the relationship between the standard peak area and the corresponding internal standard peak area ratio and the concentration of the standard solution.

【技术实现步骤摘要】
高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法
本专利技术涉及维生素D检测的领域，特别涉及一种高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法精准快速地获取25-羟基维生素D的定量数据。
技术介绍
维生素D是一类脂溶性维生素，在维持人体内钙的动态平衡方面起着非常重要的作用，其能和钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼的强度。此外，维生素D还有着广泛的非骨骼效应，与心血管疾病、免疫疾病、糖尿病和肿瘤等疾病密切相关，维生素D的缺乏可导致骨骼发育受损，以及各类慢性疾病的发病风险增加，如类风湿性关节炎、软骨化、冠心病、糖尿病和肿瘤等。人体内维生素D的来源主要有两个途径，一是通过膳食途径摄入的维生素D2(酵母或真菌)和维生素D3(鱼、鱼肝油或蛋黄)，二是机体经光照将皮肤中的7-脱氢胆甾醇转化为维生素D3。然而这些维生素D在肝脏中可转化为25-羟基维生素D(25-OHD)，从而被机体转运或储藏，另外，25-OHD在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此25-OHD可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素D水平。目前，25-OHD的检测方法有多种，包括免疫检测、HPLC法和LC-MS/MS方法等。其中，由于25-羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此在检测时存在严重的基质干扰，而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰，对比而言，LC-MS/MS法具有特异性强、准确度高、分析时间短等特点，被认为是评价机体维生素D营养状况的“金标准”。现有公开专利文献申请号201510530370.0“超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法”以及2008年10月公布的“THEANNALYSOF25-HYDROXYVITAMINDINSERUMUSINGUPLC/MS/MS”的文献公开了一种利用超高效液相色谱串联质谱法检测25羟基维生素D的方法，但是其公开的方法存在两大不可避免的缺陷：1.只着重于强调定性检测25羟基维生素D的方法，无法同时准确定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，也无法给出准确的25-羟基维生素D的含量，虽然在文献中稍微待过提及定量检测的可能性，但是其具体方案并无揭露。2.待测样本的前处理步骤过于繁琐，进而导致分析时间长，方法的特异性差，检测通量低。综上所述，为了更好地高效检测25-羟基维生素D，急需一种在原有检测方法基础上更加优化并且可高通量定量检测25-羟基维生素D的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法可被用于高通量地获取25-羟基维生素D的定量数据，且其方法的检测时间短，且有高灵敏度，满足临床检测的需求。本专利技术的目的在于提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法改进现有技术的定性检测方法，待测样本的前处理步骤简单易处理，又便于操作。本专利技术的目的在于提供一高通量快速测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法可准确分离并且分别获取25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量。本专利技术的目的在于提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法被应用于获取25-羟基维生素D的准确含量数据，从而被应用于评价机体维生素D营养状况。为了达到以上专利技术目的，本专利技术提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，包括以下步骤：S1:待测样本的前处理：取血清样品加入含有25-羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第一上清液，向下层溶液再加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后离心得到待测样本；S2:超高效液相色谱串联质谱完成检测所述待测样本，获得所述待测样本的峰面积和对应内标峰面积；以及S3:代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值到线性回归方程，得到待测样本的含量，其中所述线性回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。在一些实施例中，所述步骤S1当中所述25-羟基维生素D同位素的内标物中25-羟基维生素D同位素选择为d3-25羟基维生素D2和/或d3-25羟基维生素D3。在一些实施例中，所述涡旋震荡时间均控制在4分钟，在获得所述上清液的时候以及添加所述复溶液后的离心条件为：4℃条件12000rpm下离心5分钟，所述氮气吹干的条件为室温下完成氮气的吹干，所述复溶液选择为80％的甲醇溶液。在一些实施例中，所述步骤S2当中,所述液相色谱的条件为：流动相A液:0.1％甲酸水溶液，流动相B液:2mM甲酸铵与0.1％甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL/min，柱温为40℃，进样20μL；所用洗脱梯度：0-0.1min,85％；流动相B液在0.1-0.5min,B液升高到95％；0.5-1min,B液升至100％；1-1.5min,维持100％；B液；1.51min,B液降到85％，维持0.5min到2min。在一些实施例中，所述步骤S2当中，所述串联-质谱参考条件为：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-2.5KV；脱溶剂气流速：400-600℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多反应监测。在一些实施例中，包括以下步骤：A1:制备标准品溶液以甲醇配制25-羟基维生素D的标准品储备液，然后加入人造血清，制备不同浓度的标准品溶液，2-8℃保存备用；A2:所述标准品溶液作为步骤S1当中的样品，进行步骤S1和步骤S2的操作；A3：获取不同标准品溶液对应的内标峰面积，以所述标准品溶液的浓度为X轴，所述标准品峰面积和对应的内标峰面积的比值为Y轴，得到标准曲线，对所述标准曲线进行线性回归分析，经过“1/X”权重因子得到所述线性回归方程。在一些实施例中，所述步骤A1当中，所述标准品浓度控制在1-100ng/ml。在一些实施例中，所述标准储备溶液和所述人造血清的体积比为1:50。在一些实施例中，所述空白介质为2％甲醇人造血清。在一些实施例中，所述步骤S2当中，超高效液相色谱串联质谱的检测时间在2分钟内。附图说明图1是根据本专利技术的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的25-羟基维生素D2的MRM色谱图。图2是根据本专利技术的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的25-羟基维生素D3的MRM色谱图。图3是根据本专利技术的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的25-羟基维生素D2的定量标准工作曲线。图4是根据本专利技术的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的25-羟基维生素D3的定量标准工作曲线。图5是根据本专利技术的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中人血清样品中25-羟基维生素D2色谱图。图6是根据本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一高通量测定血清中25‑羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:待测样本的前处理：取血清样品加入含有25‑羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第一上清液，向下层溶液再加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液涡旋震荡后离心得到待测样本；S2:超高效液相色谱串联质谱完成检测所述待测样本，获得所述待测样本的峰面积和对应内标峰面积；以及S3:代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值到回归方程，得到所述待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。

【技术特征摘要】
1.一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:待测样本的前处理：取血清样品加入含有25-羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第一上清液，向下层溶液再加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液涡旋震荡后离心得到待测样本；S2:超高效液相色谱串联质谱完成检测所述待测样本，获得所述待测样本的峰面积和对应内标峰面积；以及S3:代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值到回归方程，得到所述待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。2.根据权利要求1所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2当中,所述液相色谱的条件为：流动相A液:0.1％甲酸水溶液，流动相B液:2mM甲酸铵与0.1％甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL/min，柱温为40℃，进样20μL；所用洗脱梯度：0-0.1min,85％；流动相B液在0.1-0.5min,B液升高到95％；0.5-1min,B液升至100％；1-1.5min,维持100％；B液；1.51min,B液降到85％，维持0.5min到2min。3.根据权利要求2所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2当中，所述串联-质谱参考条件为：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-2.5KV；脱溶剂气流速：400-600℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多反应监测。4.根据权利要求3所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，海云，陈亮，栾羽，张志栋，黄新良，徐可丰，李冰，罗示齐，王万强，黄曙，刘礼欢，周响响，应海媚，
申请(专利权)人：杭州度安医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33