一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法技术

一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，本发明专利技术涉及一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，本发明专利技术的目的是为了提高血小板裂解液中CD41+、CD81+的微囊，本发明专利技术通过冲击波分级冲击，增加形成和释放了血小板中的细胞因子和CD41+、CD81+的微囊。本发明专利技术的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/mL，微囊总蛋白为7‑9μg/mL，有69.33±2.33％微囊粒径集中在30‑150nm范围，15.10±3.20％微囊粒径集中在150‑300nm范围，可以释放大量的血小板细胞因子，本发明专利技术应用于生物技术领域。

Preparation method of platelet lysate containing CD41+ and CD81+ microcapsules

The invention relates to a preparation method of platelet lysate rich in CD41+, CD81+ microcapsules, which relates to a preparation method of platelet lysate rich in CD41+, CD81+ microcapsules. The purpose of the present invention is to improve the microcapsules of CD41+, CD81+ in platelet lysate, and the present invention increases the formation and release of blood cells by shock wave grading impact. The cytokine in the plate and the microcapsules of CD41+ and CD81+. The microcapsule concentration in the platelet lysate of the present invention is 120 ug/mL, the total protein of the microcapsule is 7_9 ug/mL, the particle size of the microcapsule is 69.33 (+ 2.33%) concentrated in the range of 30_150 nm, and the particle size of the microcapsule is 15.10 (+ 3.20%) concentrated in the range of 150_300 nm, which can release a large number of platelet cytokines. The present invention is applied in the field

【技术实现步骤摘要】
一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法
本专利技术涉及一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法。
技术介绍
血小板在很长时间内被看作是血液中的无功能的细胞碎片，直到1882年意大利医师Bizzozero发现它们在血管损伤后的止血过程中起着重要作用，才首次提出血小板的命名也从此开启了探究血小板凝血、止血、维护毛细血管壁完整性历程。现在人们已经认识到，血小板具有重要的功能。血小板从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质，体积小，直径为2-3微米，无细胞核。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为每立方毫米10～30万)。血小板在生理状态的血小板成静息状态，其胞内溶酶体、致密颗粒和α颗粒含有大量凝血因子、细胞因子、趋化因子、粘附因子、免疫蛋白、呈现一种平衡状态。当血管受损害或破裂时，血小板受刺激，由静止相变为机能相，迅即发生变形，表面粘度增大，凝聚成团；同时在表面第Ⅲ因子的作用下，使血浆内的凝血酶原变为凝血酶，从而实现病理状态的血小板激活。大量的细胞因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)等150多种因子和胞外微囊，在激活的过程中从血小板α颗粒中释放出来，起到刺激细胞扩增、伤口愈合、炎症反应、血栓形成、免疫调节等作用。近20年来血小板的作用已被应用于多学科临床实践，包括颌面外科，骨科，心胸外科、神经外科，妇产科、眼科、普外整形美容科等等。血小板内的细胞因子、胞外微囊可以通过采用胶原，凝血酶，氯化钙，机械损伤，体外裂解等多种形式从血小板中释放出来，而且释放效率和数量因方法不同而结果不同，在未来的应用效果也不尽相同，由于胞外微囊由于其载药能力、富含生长因子在临床应用前景越来越受到科学界的重视。血小板分泌的胞外微囊(EV)直径在30-500nm范围，其中30-140nm大小的也称为外泌体(exosomes)，体积150nm以上的也被成为血小板微粒(MPs)，由于其富含细胞因子和有效物质细胞内外传递作用，因此二者均有组织再生修复功能，并且组织修复能力的大小和微囊含量正相关。目前常用在临床的方法为采用凝血酶和钙离子进行激活，而这种方法对血小板分泌物，特别是有再生修复能力的CD41+、CD81+微囊释放浓度低于10μg/mL，血小板裂解液中微囊的含量少，从而并未实现血小板的再生修复功能的最佳状态。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提高血小板裂解液中CD41+、CD81+微囊的含量，提供了一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法。本专利技术一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，37度孵育10-15分钟；二、再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm2，室温下冲击700-1000次，37度孵育20-30分钟；三、然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm2，室温下冲击1500-2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；四、将步骤三的悬液放入密封冻存管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后进行离心，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。本专利技术的有益效果：本专利技术获得富含血小板微囊方法为物理方法，没有外源添加的凝血酶、胶原或者Ca离子等生物化学成分，因此方法简便，应用过程不会因为异体蛋白引起的过敏反应，不会因为Ca离子的介入改变局部pH而造成的不适反应。本专利技术与超声波、微波方法不同，超声波、微波方法在强大的声波和电磁波下，血小板的内外膜结构均有破坏，可以释放大量的血小板细胞因子，但是破坏了亚细胞膜结构的微囊化形成。本专利技术采用了多级冲击波刺激法充分血小板中的CD41+、CD81+微囊以及血小板内的细胞因子。血小板亚细胞膜结构经冲击后，释放更多的30-300nm的微囊和细胞因子，从而起到血小板内再生修复作用的内容充分物释放的作用，本专利技术的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/mL，微囊总蛋白为7-9μg/mL，有69.33±2.33％微囊粒径集中在30-150nm范围，15.10±3.20％微囊粒径集中在150-300nm范围，本专利技术获得的微囊以粒径小的外泌体为主，预期其再生修复功能会更强。附图说明图1为实施例一微囊的浓度NTA分析图；图2为实施例一微囊的粒径NTA分析图；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本专利技术组；图3为实施例一制备的血小板裂解液中微囊总蛋白和表面标记表达情况图；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本专利技术组；图4为实施例一中PDGF-AB和TGF-β在血小板裂解液和微囊上的含量测定；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本专利技术组；图5为实施例一中bFGF和VEGF在血小板裂解液和微囊上的含量测定；其中a为对照组、b为凝血酶组、c为本专利技术组；图6为实施例一SD大鼠注射STZ建立I型糖尿病模型中伤口恢复情况。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，37度孵育10-15分钟；二、再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm2，室温下冲击700-1000次，37度孵育20-30分钟；三、然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm2，室温下冲击1500-2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；四、将步骤一的悬液放入冻存管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后进行离心，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。本实施方式通过血小板采集机、外周血多次离心浓缩、或者外周血淋巴细胞分离液浓缩获得的富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水。血小板来自成人的静脉血、动脉血、脐带血、胎盘血或者动物的血液。本实施方式的有益效果：一、本实施方式获得富含血小板微囊方法为物理方法，没有外源添加的凝血酶、胶原或者Ca离子等生物化学成分，因此方法简便，应用过程不会因为异体蛋白引起的过敏反应，不会因为Ca离子的介入改变局部pH而造成的不适反应。二、本专利技术与超声波、微波方法不同，超声波、微波方法在强大的声波和电磁波下，血小板的内外膜结构均有破坏，可以释放大量的血小板细胞因子，但是破坏了亚细胞膜结构的微囊化形成，其再生修复能力也会减弱。三、本实施方式采用了多级冲击波刺激法充分血小板中的CD41+、CD81+微囊以及血小板内的细胞因子。血小板亚细胞膜结构经冲击后，释放更多的30-300nm的微囊和细胞因子从而起到血小板内再生修复作用的内容本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200‑500次后，37度孵育10‑15分钟；二、再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm2，室温下冲击700‑1000次，37度孵育20‑30分钟；三、然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm2，室温下冲击1500‑2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；四、将步骤三的悬液放入密封冻存管中，放入液氮冷冻20‑40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4‑6次，然后进行离心，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。

【技术特征摘要】
1.一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm2，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，37度孵育10-15分钟；二、再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm2，室温下冲击700-1000次，37度孵育20-30分钟；三、然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm2，室温下冲击1500-2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；四、将步骤三的悬液放入密封冻存管中，放入液氮冷冻20-40分钟，取出后放入水浴摇荡融解，重复操作4-6次，然后进行离心，取上清液，再用针头过滤器过滤上清液，收集滤液，得到富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液。2.根据权利要求1所述的一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，其特征在于步骤一中富含血小板血浆或者富含血小板生理盐水中血小板浓度为(6～15)×105个/μL。3.根据权利要求1所述的一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，其特征在于步骤一、二和三中孵育均是在37℃的CO2培养箱中进行的。4.根据权利要求1所述的一种富含CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怡，牛春玮，吕秀明，刘艳青，
申请(专利权)人：天晴干细胞股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23