一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型及其建立方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，尤其涉及一种细胞激素耐药模型及其建立方法。一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，该淋巴细胞激素耐药模型由获取的NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞进行0.5～4μg/ml注射用甲基强的松龙干预获得。本发明专利技术采用低剂量甲基强的松龙诱导人淋巴细胞产生获得性激素耐药，表现为P‑gp表达的上调和其转运底物罗丹明‑123在细胞内积累减少，成功构建激素耐药细胞模型。但以人为对象的研究，受到取材、伦理等多种因素的限制，给进一步深入研究激素耐药及逆转机制带来不便，若能在动物中也复制出相应的淋巴细胞激素耐药模型，将会给进一步深入研究带来极大的方便。

A model of spleen lymphocyte hormone resistance in NZW/LacJ lupus mice and its establishment

The invention belongs to the field of biological medicine, in particular to a cytokine resistance model and a method for its establishment. A hormone-resistant model of splenic lymphocyte in NZW/LacJ lupus mice was established by intervening the splenic lymphocyte of NZW/LacJ lupus mice with methylprednisolone 0.5-4 ug/ml for injection. The invention adopts low dose methylprednisolone to induce acquired hormone resistance of human lymphocytes, which is manifested by up-regulation of P_gp expression and reduction of accumulation of its transport substrate Rhodamine_123 in cells, and successfully constructs a hormone-resistant cell model. However, the research on human beings is limited by many factors, such as material selection, ethics and so on. It is inconvenient to further study the mechanism of hormone resistance and reversal.

【技术实现步骤摘要】
一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型及其建立方法
本专利技术属于生物医药领域，尤其涉及一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型及其建立方法和应用。
技术介绍
系统性红斑狼疮(SLE)是一种以多系统或器官病变和血清中出现多种自身抗体为特征的自身免疫性疾病，外周血淋巴细胞的异常活化是SLE乃至各种免疫性疾病的重要特征，也是糖皮质激素或免疫抑制剂作用的重要靶细胞。因此对外周血淋巴细胞活性及功能的干预是SLE体外研究的重要途径。有研究认为，小鼠淋巴细胞与大鼠、人等种类的淋巴细胞不同，对体外生长刺激因子如刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)等反应性非常低，因此小鼠淋巴细胞的培养过程中必需添加另外的营养和生长刺激因子成分，其中IL-2被认为是必须的。P-gp是一种ATP依赖性的跨膜转运蛋白，是最早发现的一种与肿瘤多药耐药(muhidrugresistance，MDR)有关的蛋白质，它能将多种结构和药效不同的化合物排出细胞，导致肿瘤化疗失败。但P-gp不仅在肿瘤细胞中高表达，而且在很多正常组织中表达，如多功能干细胞、单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞等。淋巴细胞作为机体最主要的免疫细胞，又是SLE等自身免疫疾病的主要治疗靶点，探讨其P-gp表达特点及其与激素耐药的关系，有着重要的理论和临床价值。在构建细胞多药耐药模型方面，虽然肿瘤研究领域已经拥有了较为成熟的方法，并积累了丰富的经验，但这一方法并不完全适合于构建淋巴细胞的多药耐药模型。其原因是：肿瘤细胞株具有可传代的特点，构建肿瘤细胞多药耐药模型时，通过小剂量细胞毒药物的间断反复使用，即可通过不断筛选而构建耐药模型。而成熟淋巴细胞属于原代细胞，不能传代，若采用细胞毒药物，则细胞将会大量死亡而导致造模失败。
技术实现思路
为了解决上述的问题，本专利技术的一个目的是提供一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，该模型采用小剂量甲强龙诱导，既避免了细胞死亡，又能成功诱导P-gp的高表达，本专利技术的另外一个目的是提供上述的耐药模型的建立方法。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，该NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型由NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞用注射用甲基强的松龙干预获得。作为优选，所述注射用甲基强的松龙的浓度为0.1～4μg/mL。作为优选，所述注射用甲基强的松龙的浓度为2～4μg/mL。本专利技术的另一个目的是提供一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型的建立方法，其中，该方法包括如下步骤：1)分离NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞；2)将NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞进行注射用甲基强的松龙干预；3)培养、分离。作为优选，所述步骤2)中的注射用甲基强的松龙的浓度为0.1～4μg/mL。更优选地，所述注射用甲基强的松龙的浓度为2～4μg/mL；由于细胞内R-123积累水平与P-gp表达呈负相关，前者为后者的转运底物，既避免了细胞死亡，又能成功诱导P-gp的高表达。在本专利技术一个最优选的实施方案中，所述注射用甲基强的松龙的浓度为2μg/mL时，细胞内罗丹明积累明显减少，成功诱导P-gp的高表达。作为优选，所述步骤3)中的培养条件为：30℃～40℃，2～5％二氧化碳浓度，培养24～72小时。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的干预的方法为将NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞置于多孔板中，加入注射用甲基强的松龙干预淋巴细胞，37℃，5％二氧化碳浓度，培养72小时。作为优选，所述步骤3)中的分离方法为：将培养的淋巴细胞从多孔板转入离心管离心，弃培养基；PBS重悬，离心，洗细胞。在本专利技术一个具体实施例中，所述的干预后进行细胞分离，细胞分离的方法为将培养的淋巴细胞从多孔板转入1.5mL离心管中，1500rpm，4℃,5分钟离心，弃培养基；100μlPBS重悬，1500rpm，4℃,5分钟离心，洗细胞3次。作为优选，所述步骤1)中的NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞的获取方法如下：1)断颈处死小鼠，浸泡于乙醇中；2)在培养皿中放入Mouse1×淋巴细胞分离液，取用前摇匀；在超净台中取出小鼠脾脏；放入尼龙网中，并浸入含淋巴细胞分离液的培养皿中；3)用1mL玻璃注射器芯轻轻研磨，直至肉眼见仅余白色结缔组织；4)把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，覆盖200-500μL的1640培养基，保持液面分界明显；5)室温，离；离心结束后细胞分层：最上层为培养基覆盖层，接着为淋巴细胞层，再往下为淋巴细胞分离液层，最下层为红细胞、其他细胞及细胞碎片；6)吸出淋巴细胞层，再加入1640培养基，颠倒洗涤；室温，离心收集细胞；7)倾倒上清液，用无血清培养基重悬细胞；8)细胞悬液，加入PBS中，加入台盼兰，计数细胞。在本专利技术一个具体的实施例中，所述的NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞的获取方法如下：1)断颈处死小鼠，浸泡于75％的乙醇中；2)在培养皿中放入Mouse1×淋巴细胞分离液，取用前摇匀；在超净台中取出小鼠脾脏；放入尼龙网中，并浸入含淋巴细胞分离液的培养皿中；3)用1mL玻璃注射器芯轻轻研磨，直至肉眼见仅余白色结缔组织；4)把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，覆盖200-500μL的1640培养基，保持液面分界明显；5)室温，800g离心30min；离心结束后细胞分层：最上层为培养基覆盖层，接着为淋巴细胞层，再往下为淋巴细胞分离液层，最下层为红细胞、其他细胞及细胞碎片；6)吸出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，颠倒洗涤；室温，1500g离心10min收集细胞；7)倾倒上清液，用无血清培养基重悬细胞；8)100μl细胞悬液，加入900μlPBS中，加入0.4％台盼兰，至终浓度为0.04％，室温二分钟，计数细胞。本专利技术再一个目的是提供上述所述NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型在筛选逆转激素耐药药物的应用；其中，该NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型由NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞用注射用甲基强的松龙干预获得。狼疮动物模型有多种，本专利技术选用的为自发性狼疮小鼠NZW/LacJ,NZW小鼠拥有正常的寿命，但会产生抗-DNA的抗体，血清中有高水平的逆转录病毒gp70抗原，且该鼠发生的肾小球肾炎与人类LN相似，故本专利技术选择该模型鼠有利于使研究结果尽可能接近人类疾病本身。脾脏是机体最大的淋巴器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是细胞免疫和体液免疫的中心，是获取小鼠大量淋巴细胞的理想取材部位。本专利技术采用的脾脏淋巴细胞分离方法通过研磨及尼龙网过滤获得脾脏细胞后，以红细胞裂解液裂解红细胞并洗去血红蛋白，通过梯度离心法吸取中间云雾层即可获得较纯的淋巴细胞。研究结果也表明，采用上述分离方法所获得的细胞主要为淋巴细胞，其他白细胞成分比率低。基本不含红细胞、血小板，无血红蛋白污染，符合进一步实验要求。本专利技术采用低剂量甲基强的松龙诱导人淋巴细胞产生获得性激素耐药，表现为P-gp表达的上调和其转运底物罗丹明-123在细胞内积累减少，成功构建激素耐药细胞模型。但以人为对象的研究，受到取材、伦理等多种因素的限制，给进一步深入研究激素耐药及逆转机制带来不便，若能在动物中也复制出相应的淋巴细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，其特征在于：该NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型由NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞用注射用甲基强的松龙干预获得。

【技术特征摘要】
1.一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，其特征在于：该NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型由NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞用注射用甲基强的松龙干预获得。2.根据权利要求1所述的一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，其特征在于：所述注射用甲基强的松龙的浓度为0.1～4μg/ml。3.根据权利要求1所述的一种NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型，其特征在于：所述注射用甲基强的松龙的浓度为2～4μg/ml。4.一种如权利要求1～3所述的NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型的建立方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)分离NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞；2)将NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞进行注射用甲基强的松龙干预；3)培养、分离。5.根据权利要求4所述的NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型的建立方法，其中，所述步骤3)中的培养条件为：30℃～40℃，2～5％二氧化碳浓度，培养24～72小时。6.根据权利要求4所述的NZW/LacJ狼疮鼠脾淋巴细胞激素耐药模型的建立方法，其中，所述步骤3)中的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁盈，
申请(专利权)人：浙江省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33