The invention provides a method for separating and purifying intrinsic lymphocytes from mouse intestinal mucosa. The specific process is as follows: obtaining animal intestine, putting it into centrifugal tube after cleaning and cutting, adding epithelial stripping liquid to stir and strip off, removing supernatant, adding neutralization liquid 1 to stir, removing supernatant, adding neutralization liquid 2 to static separation. Remove the supernatant, add digestive enzyme mixture, stir digestion; add HBSS centrifugation, remove the supernatant, suspend with HBSS and filter; the filtrate after centrifugation with Percoll liquid suspension and then move to the bottom of the Percoll liquid centrifugal tube; centrifugation, intermediate layer cell collection, centrifugation, collection of precipitation; after dilution with antibody suspension obtained Cell mass, centrifugation, collection of precipitation; flow buffer suspension precipitation, up-machine flow cytometry to obtain ILC. The intrinsic lymphocytes were isolated from the intestinal mucosa of mice and purified by this method. The obtained lymphocytes were large in number, high in viability and high in purity, which laid a foundation for the study of intestinal mucosal immunity.
【技术实现步骤摘要】
一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法
本专利技术属于细胞分离纯化
,具体涉及一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法。
技术介绍
近年来,随着免疫活性细胞分离方法的进步,肠道黏膜免疫得到越来越多的免疫科学工作者的重视,肠道黏膜免疫的研究已成为免疫学研究热点之一。肠道黏膜免疫系统是潜在病原体、食品以及共生菌的共同入口。肠道黏膜免疫系统长期暴露于复杂的环境中,因此能够对食品和共生菌的刺激产生耐受,同时对病原体的刺激产生免疫反应。肠黏膜主要由上皮层、固有层及浆膜层构成,含有种类丰富、数目繁多的免疫细胞,是哺乳动物识别、捕获经消化道进入体内的外界病原微生物的重要场所,其功能与感染、肿瘤等多种疾病密切相关。固有淋巴细胞(ILC,InnateLymphoidCell)是新近发现的一类新型非T非B淋巴细胞。ILC具备固有免疫细胞(又称先天性免疫细胞)的基本特征,却同时能够分泌细胞因子参与获得性免疫应答(又称后天性免疫应答)。近年针对ILC的研究逐渐兴起,有助于提升抗感染、抗肿瘤等临床诊疗水平。对肠黏膜中原代ILC进行分离纯化是开展此类研究的关键前提条件。目前多从肺、脾等实质脏器或外周血中提取ILC,尚缺少自小肠、结肠等空腔脏器中提取ILC的方法。肠黏膜中存在种类繁多的细胞类型(如上皮细胞、T/B淋巴细胞、单核/树突状细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等),分离提取过程中其他细胞导致的背景干扰较大;另外,ILC数目较少、比例较低(<1%),造成从肠黏膜中提取ILC比从实质脏器或血液中提取ILC更难,且当前从实质脏器或血液中提取ILC的方法无法用于 ...
【技术保护点】
1.一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法,其特征在于,具体过程如下:1)获取动物小肠,经清洗、剪碎后置于离心管中,加入上皮剥离液搅拌剥离;2)移除上清液,加入中和液1,搅拌;3)移除上清液,加入中和液2,静置分离;4)移除上清液,加入消化酶混合液,搅拌消化;5)加入HBSS离心,移除上清后,用HBSS重悬后过滤;6)步骤5)所得滤液离心后用第一Percoll液重悬后移至底部铺有第二Percoll液的离心管;7)离心,取中间层细胞收集,再次离心,收集沉淀;8)用稀释后抗体混悬第7)所得的细胞团,离心,收集沉淀;9)用流式缓冲液重悬沉淀,上机流式细胞仪得到ILC。
【技术特征摘要】
1.一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法,其特征在于,具体过程如下:1)获取动物小肠,经清洗、剪碎后置于离心管中,加入上皮剥离液搅拌剥离;2)移除上清液,加入中和液1,搅拌;3)移除上清液,加入中和液2,静置分离;4)移除上清液,加入消化酶混合液,搅拌消化;5)加入HBSS离心,移除上清后,用HBSS重悬后过滤;6)步骤5)所得滤液离心后用第一Percoll液重悬后移至底部铺有第二Percoll液的离心管;7)离心,取中间层细胞收集,再次离心,收集沉淀;8)用稀释后抗体混悬第7)所得的细胞团,离心,收集沉淀;9)用流式缓冲液重悬沉淀,上机流式细胞仪得到ILC。2.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法,其特征在于,步骤1)获取动物小肠后放入HBSS液中,移除肠系膜及其脂肪、Peyer氏结;纵行剖开肠壁,用PBS液清洗,将肠管剪碎后置于4℃PBS液中暂存。3.根据权利要求2所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法,其特征在于,所述加入上皮剥离液搅拌剥离的具体过程如下:加入37℃的上皮剥离液、磁力搅拌珠,将离心管倒置于磁力搅拌仪表面,在37℃5%CO2培养箱内,以400rpm磁力搅拌30分钟;所述上皮剥离液为HBSS+EDTA+DTT+HEPES+FBS的混合溶液,其中EDTA终浓度5mM、DTT终浓度1mM、HEPES终浓度25mM、FBS终浓度5%。4.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法,其特征在于,所述中和液1为RPMI+EDTA+FBS的混合溶液,其中EDTA终浓度1mM、FBS终浓度10%;所述步骤2)中搅拌的具体过程为:将步骤2)的离心管倒置放于磁力搅拌仪表面,于37℃5%CO2培养箱内,以200rpm磁力搅拌15分钟。5.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法,其特征在于,所述中和液2为RPMI...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘颂,管文贤,王萌,缪骥,
申请(专利权)人:南京鼓楼医院,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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