本发明专利技术属于生物制药领域，公开一种具有降尿酸功效的合成多肽及其制备方法与应用和编码该多肽的基因。本发明专利技术所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供一种固相合成方法合成新型降尿酸三肽，经体外降尿酸实验证明，具有显著降尿酸功效。本发明专利技术所述作用机制通过计算机分子对接模拟技术分析，结果表明疏水相互作用是本发明专利技术发挥降尿酸作用的关键。本发明专利技术可用于制备抗高尿酸血症及痛风疾病相关的药品及保健食品领域，应用范围广且安全性高，具有良好的社会经济效益。
Synthetic polypeptide with uric acid reducing effect and its preparation method, application and gene encoding this polypeptide
The invention belongs to the field of biopharmaceuticals, and discloses a synthetic polypeptide with the function of reducing uric acid, a preparation method, application and a gene encoding the polypeptide. The amino acid sequence of the synthetic polypeptide is shown in SEQ ID NO:1. The invention provides a solid-phase synthesis method for synthesizing a novel tripeptide of hyaluronic acid, which is proved to have remarkable hyaluronic acid effect by in vitro hyaluronic acid experiment. The mechanism is analyzed by computer molecular docking simulation technology, and the results show that the hydrophobic interaction is the key for the invention to play the role of reducing uric acid. The invention can be used for preparing medicine and health food related to Anti-hyperuricemia and gout disease, has wide application range and high safety, and has good social and economic benefits.
【技术实现步骤摘要】
一种具有降尿酸功效的合成多肽及其制备方法与应用和编码该多肽的基因
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种具有降尿酸功效的多肽合成方法、应用及其作用机制。
技术介绍
高尿酸血症是一种血清尿酸浓度过高导致的嘌呤代谢疾病。人体中尿酸主要以尿酸盐的形式存在，在生理条件下，女性正常血尿酸浓度为178.4-297.4μmol/L(3-5mg/dL)，男性正常血尿酸浓度为237.9-356.9μmol/L(4-6mg/dL)。男性血尿酸浓度明显高于女性血尿酸浓度，当女性血清尿酸浓度高于360μmol/L(6mg/dL)，男性血清尿酸浓度高于420μmol/L(7mg/dL)时为高尿酸血症。当血清尿酸浓度过高时，尿酸盐沉积在关节处，导致痛风石的形成，进而引发痛风，同时可能伴随糖尿病、高血压、心脑血管疾病、冠心病、肾脏病变等多种代谢综合症。尿酸具有抗氧化性，能直接清除体内的氧自由基、单线态氧及过氧化物，能保护人体血液中的抗坏血酸使其免于被氧化。因此，人体血清尿酸水平应维持在正常范围内。人体中尿酸主要由肝脏产生，在嘌呤代谢的最后一步，由黄嘌呤氧化酶(XOD)催化黄嘌呤或次黄嘌呤最终生成尿酸。尿酸产生有两种途径:一是通过嘌呤类食物的代谢(外源性)，占人体内尿酸总量的20％；二是通过体内核酸类物质分解代谢产生(内源性)，占总量的80％。机体合成的尿酸有2/3通过肾脏排泄，其余1/3由肠道排泄。因此，通过减少尿酸的生成和促进尿酸的分解代谢可以缓解高尿酸血症及痛风等疾病。降低尿酸生成的药物主要包括别嘌呤醇(Allopurinol)、非布司他(Febuxostat)和托匹司他(Topiroxostat)等，主要通过抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性减少尿酸的生成。促进尿酸排泄的药物有丙磺舒(Probenecid)、苯溴马隆(Benzbromarone)、RDEA594等。促进尿酸分解的药物有拉布立酶(Rasburicase)、聚乙二醇尿酸酶(PEG-uricase)、培戈洛酶(Pegloticase)等。这些药物都能够降低血清尿酸水平，但同时对人体脏器具有一定的毒副作用，易引起严重的过敏及炎症反应。因此，天然产物降尿酸物质由于毒副作用小逐渐受到研究工作者的关注。生物活性肽具有抗肿瘤、降血压、降血糖、抗炎症、抗氧化、抗衰老等生理功能，较蛋白质和氨基酸更易被人体吸收，且无毒副作用。但目前，有关降尿酸生物活性肽的报道相对较少，这些食物来源的活性肽具有体外黄嘌呤氧化酶抑制活性和降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的功效。海洋鱼类酶解可得生物活性肽，刘洋等以海洋鱼蛋白为原料，响应面分析法优化酶解工艺后制得活性较好的抗痛风肽，具有显著的体外XOD抑制活性。进一步研究其作用机理发现，海洋鱼蛋白肽能够有效抑制高尿酸血症大鼠的XOD活性，并降低其肝脏中ADA和XODmRNA的表达水平，同时具有良好的肾脏保护功效。此外，酶解液经纯化鉴定后，合成的多肽序列也具有体外黄嘌呤氧化酶抑制活性和降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的作用。据报道，鲨鱼软骨水提物中鉴定合成的18条多肽，每条多肽都含有Tyr、Trp、Phe等芳香性氨基酸。通过高尿酸血症动物模型评价合成多肽的活性，结果表明Tyr-Leu-Asp-Asn-Tyr(YLDNY)和Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Pro-Tyr(SPPYWPY)以静脉注射方式处理高尿酸血症大鼠后，能够显著降低其血尿酸含量，YLDNY以口服方式处理也能降低其血尿酸含量。进一步研究发现，来源于YLDNY的某些二肽或三肽，其中Asp-Asn片段具有较好的XOD抑制活性，说明YLDNY在体内可能以二肽或三肽的方式被吸收后，通过抑制XOD活性降低大鼠血清尿酸。因此，多肽作为降尿酸保健品及药物的研制具有广阔的市场前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种合成多肽的制备方法与应用，并通过分子对接技术分析其降尿酸的作用机制。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种具有降尿酸功效的合成多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。其氨基酸序列为Trp-Met-Leu，具有体外降尿酸活性。其中，Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸相应残基；Met表示英文名称为methionine，中文名称为甲硫氨酸的氨基酸相应残基；Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸相应残基。编码权利要求1所述合成多肽的基因，其基因序列tggatgctg，如序列表SEQIDNo:2所示。本专利技术提供了编码合成多肽的DNA分子。由于密码子的简并性，可能存在多种核苷酸序列。本专利技术所述多肽的DNA分子编码，通过选择构成所述氨基酸序列氨基酸残基的密码子，从而确定和提供所述多肽氨基酸序列的DNA分子，均为本领域技术人员利用现有方法便可制备合成的。制备所述一种具有降尿酸功效的合成多肽的方法，其通过固相合成方法，按照SEQIDNO：1所示合成多肽的氨基酸序列，以芴甲氧羰基(Fmoc)作为氨基酸的保护基，从C端到N端通过逐一偶联氨基酸的方式合成，脱除Fmoc保护基同时偶联固体树脂形成多肽树脂，在裂解剂和侧链保护基脱除剂的作用下使得外层树脂裂解，并脱去侧链的Fmoc保护基后，即能得到所述合成多肽。所述多肽的固相合成方法，按照所述合成多肽氨基酸序列从C端到N端进行逐一偶联氨基酸的方式合成。进一步的，所述固体载体树脂为4-(羟甲基)苯氧甲基聚苯乙烯树脂(Wang树脂)，以共价键的形式与氨基酸的C端相连，同时在多肽合成过程中作为逐个延伸偶联接肽反应的载体。进一步的，所述逐个延伸偶联采用的偶联剂为HOBT/HBTU混合偶联剂。进一步的，所述裂解剂是质量浓度为20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液。进一步的，所述侧链保护基脱除剂为三氟乙酸、酒石酸乙二胺、蒸馏水、TIS的混合溶液。本专利技术提供的所述合成多肽能在制备抗高尿酸血症药物中的应用。前述应用中，体外降尿酸活性通过检测黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸速率的相对抑制率进行确定。所述合成多肽对黄嘌呤氧化酶的抑制作用机理，采用分子对接技术来评价。在本专利技术具体实施方式中，按照SEQIDNO：1所示序列，采用Fmoc保护基保护氨基酸的氨基，氨基酸原料为Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Met(trt)-OH、Fmoc-Leu(boc)-OH,以及Wang树脂进行偶联，具体地按照C端到N端的氨基酸顺序，将保护氨基酸原料和树脂进行逐一偶联，然后裂解液脱除树脂和侧链保护基，获得多肽粗品，经分离纯化后获得目标多肽。其中，本专利技术所述逐一偶联的偶联剂采用HOBT/HBTU混合偶联剂，偶联效果更优于单一偶联剂，且所述偶联剂用量优选为过量。本专利技术所述多肽制备方法中偶联方式，偶联前需对Fmoc保护的氨基酸进行脱除Fmoc处理。具体实施例中，所述脱除Fmoc的试剂为20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，搅拌反应时间30min，即可除去Fmoc保护基。作为优选，本专利技术所述裂解Wang树脂的裂解脱除剂优选为三氟乙酸、酒石酸乙二胺、蒸馏水和TIS的混合溶液，具体地为三氟乙酸：酒石酸乙二胺：蒸馏水：TIS＝94.5:2.5:2:1的混合体系，反应时间为2h。此外，本专利技术采用体外黄嘌呤氧化酶催化反应方法检测了合成多肽的降尿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有降尿酸功效的合成多肽，其特征在于，其氨基酸序列为Trp‑Met‑Leu，如序列表 SEQ ID No:1所示，具有体外降尿酸活性。
【技术特征摘要】
1.一种具有降尿酸功效的合成多肽，其特征在于，其氨基酸序列为Trp-Met-Leu，如序列表SEQIDNo:1所示，具有体外降尿酸活性。2.编码权利要求1所述合成多肽的基因，其特征在于基因序列如序列表SEQIDNo:2所示。3.制备权利要求1所述一种具有降尿酸功效的合成多肽的方法，其特征在于，通过固相合成方法，按照SEQIDNO：1所示合成多肽的氨基酸序列，以芴甲氧羰基Fmoc作为氨基酸的保护基，从C端到N端通过逐一偶联氨基酸的方式合成，脱除Fmoc保护基同时偶联固体树脂形成多肽树脂，在裂解剂作用下使得外层树脂裂解，并采用侧链保护基脱除剂去除Fmoc保护基后，即能得到所述合成多肽。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固体载体树脂为4-(羟甲基)苯氧甲基聚苯乙烯树脂以共价...
【专利技术属性】
技术研发人员：任娇艳，李宇娟，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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