细胞块、细胞结构体以及立体组织体制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种利用以温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面来高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法。本发明专利技术的细胞块、细胞结构体或立体组织体的制造方法的特征在于，在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面种植细胞，进行培养。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞块、细胞结构体以及立体组织体
本专利技术涉及一种利用以温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的培养面来高效地制造细胞块、细胞结构体或立体组织体的方法，以及通过该方法而得到的细胞块、细胞结构体以及立体组织体。特别地，本专利技术(I)涉及软骨细胞块和移植材料的制造方法、软骨细胞块、移植材料以及复合材料。此外，本专利技术(II)涉及上皮细胞的培养方法、细胞结构体的制造方法以及上皮细胞用细胞培养器。此外，本专利技术(III)涉及立体组织体的制作装置和立体组织体的制作方法。此外，本专利技术(IV)涉及细胞结构体的制造方法。此外，本专利技术(V)涉及细胞结构体的制造方法、细胞结构体、细胞培养器。此外，本专利技术(VI)涉及细胞结构体的制造方法。此外，本专利技术(VII)涉及细胞结构体的制造方法。
技术介绍
关于专利技术(I)，近年来，为了提高患者的QOL，期望实现定制医疗。在定制医疗中，再生医疗承担主要的作用，再生医疗使用患者自身的细胞而谋求陷于功能障碍、功能损伤的组织、器官的再生。在此，在再生医疗中，需要在细胞培养器中培养从患者的组织采取的细胞而形成组织、然后将该组织移植到患者这样的操作。因此，期望有培养细胞而形成组织等细胞结构体的技术、以原本的状态回收细胞结构体的技术。通常被取出到生物体外的细胞大多会受到使其基因调节中产生紊乱的各种压力而发生脱分化。此外，很多情况下为了使细胞增殖，也需要使其脱分化。由此，出现了以下问题：即使在简单的培养条件下培养从患者采取的细胞，细胞也大多无法维持原本的基因表达状态，因此无法形成细胞结构体甚至组织，此外，无法发挥该细胞的高度的功能。例如，在通常的聚苯乙烯制的细胞培养皿中进行细胞培养的情况下，细胞停留在形成单层状的结构，难以形成具有与高度分化的细胞中所见的结构、例如作为软骨细胞存在于生物体内时的形状的颗粒状结构同样的结构的细胞结构体，此外，软骨细胞中特殊的多个功能也会消失。关于上述问题，正在开发例如构建模拟组织结构的立体结构的细胞培养方法，例如球形培养、团簇培养、颗粒培养、三维载体培养等方法。已知有通过使用具有立体结构的细胞外基质作为细胞培养的支持物(scaffold)，从而制作具有立体结构的细胞的细胞培养方法。此外，近年来，在生物体组织再生领域中，随着无人自动化的细胞培养法、用于控制分化的药物的发现、细菌感染检查方法等相关技术的完成度的提高，逐渐盛行对模拟生物体内结构的高级的有形结构体进行自由设计的研究(参考非专利文献1、2)。特别是关于培养软骨的三维化，已知有如下成功的例子，即，将经脱分化的软骨细胞注入到有形的模具中，通过使用了BMP2、b-FGF等的化学刺激对细胞进行分化诱导，由此制备直径10mm、厚1mm尺寸的软骨盘。此外，关于专利技术(II)，在现有技术中，上皮细胞与细胞培养器的粘附性弱，使用通常的细胞培养器而进行上皮细胞的培养是极其困难的。此外，作为提高细胞粘附性的细胞培养器，已知有胶原蛋白包被细胞培养器(参考专利文献1)、纤连蛋白包被细胞培养器(参考专利文献2)、层粘附蛋白包被细胞培养器(参考专利文件3)等涂敷了细胞粘附因子的细胞培养器。然而，在使用来自天然产物的细胞粘附因子的情况下，有可能包含未知物质、病原性物质，此外，从节约动物资源的观点出发，也期望使用化学合成物质的细胞粘附因子的方法。此外，在使用胶原蛋白、纤连蛋白、层粘附蛋白等现有的细胞粘附因子的方法中，上皮细胞与培养面的粘附性称不上充分，因此目前要求上皮细胞的粘附性优异的细胞培养器。此外，关于专利技术(III)，现有技术中，作为具有立体结构的细胞结构体、人工组织体的制作方法，在球状、片状等简单的细胞结构体中，已知有悬滴法(参考非专利文献3)、低粘附性U字底培养皿(参考专利文献4)等。此外，作为复杂的三维形状的细胞结构体方面，已知有利用了3D打印机的细胞结构体。此外，关于专利技术(IV)，1900年前后开发的细胞培养技术是生物学领域中的重要的实验技术。开发初期，停留在致力于使培养基成分最优化等的驯化细胞方面，以单层培养、悬浮培养的技术为中心进行研究。近年来，已经明确在单层培养体系的细胞和生物体内组织的细胞之间，各种性质、刺激响应性、细胞功能等不同，与形成单层结构的单层培养相比，形成与生物体内的组织结构相近的3D结构的3D培养、特别是球形培养的需求正在扩大(参考非专利文献4)。已经积极开发的经典技术有：使细胞悬浮在蛋白质体系的凝胶中并使用任意的引发因素(热、光、化学交联剂等)使该细胞悬浮液凝胶化而形成3D凝胶，使细胞包埋于3D凝胶中的技术；使细胞植入多孔质的支持物中的技术；使用固定有NIPAM的培养皿来制备细胞片的层叠体的技术等。近年来正在开发的方法有：SumitomoBakeliteCO.,Ltd.的PrimeSurface等的使细胞沉降至非粘附性的圆形底面的方法；JSR公司的NanoCulturePlate、日立制作所NanoPillarPlate等的利用激光加工将平滑面制成规律的凹凸面从而提高粘附于培养面的细胞的迁移性，由此在培养面诱导细胞的自组织化的方法；可乐丽株式会社(KURARAYCO.,LTD.)的Elplasia、岩城株式会社(IWAKI&CO.,LTD)的EZSPHERE等的使用配设有无数个直径100～500μm、深度500μm左右的孔穴的培养皿，使种植于各孔穴内的细胞沉降至各孔穴的底面的方法等。此外，近年来还已知有悬滴法，上述悬滴法是在管状构件的前端制备细胞悬浮液的液滴，利用液滴的表面张力保持液滴的形状呈球状，并且保持液滴规定时间(例如，2周左右)，由此在液滴中制造球状的细胞结构体。此外，关于专利技术(V)，近年来，为了提高患者的QOL，期望实现定制医疗。在定制医疗中，再生医疗承担主要的作用，再生医疗使用患者自身的细胞而谋求陷于功能障碍、功能损伤的组织、器官的再生。在此，在再生医疗中，需要在细胞培养器中培养从患者的组织采取的细胞而形成组织，然后将该组织移植到患者这样的操作。因此，期望培养细胞而形成组织等细胞结构体的技术、以原本的状态回收细胞结构体的技术。通常被取出到生物体外的细胞大多会受到使其基因调节中产生紊乱的各种压力而发生脱分化。此外，很多情况下为了使细胞增殖，也需要使其脱分化。由此，出现了以下问题：即使在简单的培养条件下培养从患者采取的细胞，细胞也大多无法维持原本的基因表达状态，因此无法形成细胞结构体甚至组织，此外，无法发挥该细胞的高度的功能。例如，在通常的聚苯乙烯制的细胞培养皿中进行细胞培养的情况下，细胞停留在形成单层状的结构，难以形成具有与高度分化的细胞中所见的结构、例如作为软骨细胞存在于生物体内时的形状的颗粒状结构同样的结构的细胞结构体，此外，软骨细胞中特殊的多个功能也会消失。关于上述问题，正在开发例如构建模拟组织结构的立体结构的细胞培养方法，例如球形培养、团簇培养、颗粒培养、三维载体培养等方法。已知有通过使用具有立体结构的细胞外基质作为细胞培养的支持物(scaffold)，从而制作具有立体结构的细胞结构体的细胞培养方法(参考专利文献5)。此外，作为制作具有立体结构的细胞结构体的方法，还开发了使用U字底的低粘附性培养皿的方法、悬滴法。近年来，报道有通过在用特殊的温度响应性聚合物和/或温度响应性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种软骨细胞块的制造方法，其特征在于，包含种植培养工序，所述种植培养工序通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在细胞块的存在下种植能够分化成软骨细胞的细胞，对所述细胞块和所述能够分化成软骨细胞的细胞进行培养，从而制备软骨细胞块。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.29 JP 2016-016459;2016.02.15 JP 2016-026291.一种软骨细胞块的制造方法，其特征在于，包含种植培养工序，所述种植培养工序通过在用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在细胞块的存在下种植能够分化成软骨细胞的细胞，对所述细胞块和所述能够分化成软骨细胞的细胞进行培养，从而制备软骨细胞块。2.根据权利要求1所述的软骨细胞块的制造方法，其中，通过种植所述能够分化成软骨细胞的细胞并对其进行培养从而制备所述细胞块。3.根据权利要求1或2所述的软骨细胞块的制造方法，其中，进行多次所述种植培养工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的软骨细胞块的制造方法，其中，所述包覆培养面被细胞非粘附性的壁包围。5.根据权利要求4所述的软骨细胞块的制造方法，其中，将所述包覆培养面的宽度设为3mm以下，将所述壁的高度设为3mm以下。6.根据权利要求1～5中任一项所述的软骨细胞块的制造方法，其中，将所述包覆培养面每单位面积具有的所述温度响应性聚合物和温度响应性聚合物组合物的量设为0.1～3.0μg/cm2。7.根据权利要求1～6中任一项所述的软骨细胞块的制造方法，其中，在所述种植培养工序中，以0.3×104～10.0×105个/cm2的细胞密度种植所述能够分化成软骨细胞的细胞。8.一种软骨细胞块，其特征在于，是通过权利要求1～7中任一项所述的软骨细胞块的制造方法而制造的。9.根据权利要求8所述的软骨细胞块，其为甜甜圈形。10.一种移植材料的制造方法，其特征在于，包含以下工序：通过在权利要求8或9所述的软骨细胞块的存在下，种植间充质细胞，对所述软骨细胞块和所述间充质细胞进行培养，从而制备移植材料。11.一种移植材料，其特征在于，是通过权利要求10所述的移植材料的制造方法而制造的。12.一种复合材料，其特征在于，权利要求9所述的软骨细胞块设置于管状结构体的外表面。13.根据权利要求12所述的复合材料，其中，在所述管状结构体的内部设置有芯材。14.一种上皮细胞的培养方法，其特征在于，包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器；种植工序，将上皮细胞种植于所述包覆细胞培养器；以及培养工序，对粘附于所述包覆区域A的所述上皮细胞进行培养，所述包覆区域A中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。15.根据权利要求14所述的上皮细胞的培养方法，其中，所述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，所述包覆区域A内具有所述凹陷部。16.一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，包含以下工序：制备工序，制备温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物；培养器准备工序，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物包覆细胞培养器的培养面的至少一部分而形成包覆区域A，准备具有包覆区域A的包覆细胞培养器，；种植工序，将上皮细胞种植于所述包覆细胞培养器；以及培养工序，由所述上皮细胞形成块状的细胞结构体，得到粘附于所述包覆区域A的细胞结构体，所述包覆区域A中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。17.根据权利要求16所述的细胞结构体的制造方法，其中，在所述培养器准备工序中，用所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物在细胞培养器的培养面的至少一部分中与所述包覆区域A不同的位置形成包覆区域B，所述包覆区域B中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度小于200pg/mm2。18.根据权利要求16或17所述的细胞结构体的制造方法，其中，所述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，所述包覆区域A内具有所述凹陷部。19.一种上皮细胞用细胞培养器，其特征在于，在培养面的至少一部分具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域A，所述包覆区域A中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度为0.3pg/mm2以上。20.根据权利要求19所述的上皮细胞用细胞培养器，其中，在培养面的至少一部分中与所述包覆区域A不同的位置具有用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆区域B，所述包覆区域B中的所述温度响应性聚合物或所述温度响应性聚合物组合物的浓度小于200pg/mm2。21.根据权利要求19所述的上皮细胞用细胞培养器，其中，所述细胞培养器的培养面的至少一部分具有凹陷部，所述包覆区域A内具有所述凹陷部。22.一种立体组织体的制作装置，其特征在于，包含具有至少1个通孔的培养面和穿过所述通孔的轴，在所述培养面包含至少1个用温度响应性聚合物或温度响应性聚合物组合物包覆的包覆培养面，在1个所述包覆培养面的内侧具有至少1个所述通孔，所述培养面能够在所述轴的延伸方向上移动。23.根据权利要求22所述的立体组织体的制作装置，其中，具有多个所述培养面，1根所述轴穿过所述多个所述培养面的所述通孔。24.一种立体组织体的制作方法，其特征在于，使用了权利要求22或23所述的立体组织体的制作装置，包含以下工序：种植工序，在所述包覆培养面上种植至少1种细胞；以及培养工序，对种植的所述细胞进行培养，得到缠绕于所述轴周围的环状的立体组织体。25.根据权利要求24所述的立体组织体的制作方法，其中，进一步包含以下工序的重复操作：培养面移动工序，在得到缠绕于轴周围的环状的立体组织体后，使所述培养面在所述轴的延伸方向移动；种植工序...

【专利技术属性】
技术研发人员：中山泰秀，岩井良辅，根本泰，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立循环器病研究中心，
类型：发明
国别省市：日本,JP