生产L-氨基酸的方法技术

提供了用于生产L‑氨基酸例如L‑谷氨酸的方法。通过在含有果糖的培养基中培养具有L‑氨基酸生产能力的细菌，和从所述培养基或所述细菌的细胞收集L‑氨基酸来生产L‑氨基酸，所述细菌已经被修饰成非PTS果糖摄取载体的活性和果糖激酶的活性增加。

Method for producing L- amino acids

A method for producing L amino acids such as L glutamic acid is provided. The bacteria have been modified into non-PTS fructose uptake vectors with increased activity and fructokinase activity by cultivating bacteria with L_amino acid production capacity in a fructose-containing medium and collecting L_amino acids from the medium or cells of the bacteria.

【技术实现步骤摘要】
生产L-氨基酸的方法
本专利技术涉及通过使用细菌发酵生产L-氨基酸例如L-谷氨酸的方法。L-氨基酸作为调味品的原材料等在工业上有用。
技术介绍
在工业上通过例如使用具有L-氨基酸生产能力的微生物例如细菌的发酵来生产L-氨基酸(非专利文件1)。作为此类微生物，例如，已经使用了从天然分离的菌株及其突变菌株。另外，可以通过使用重组DNA技术改善微生物的L-氨基酸生产能力。例如，作为改善细菌的L-谷氨酸生产能力的手段，已知提高磷酸转酮酶活性(专利文件1)和利用突变体yggB基因(专利文件2)。细菌可以从细胞外部摄取多种糖，并利用它们作为碳源。细菌的糖摄取系统的实例包括磷酸转移酶系统(PTS)，其参与糖的磷酸化，和非PTS，其不参与糖的磷酸化。例如，谷氨酸棒杆菌具有FruA蛋白，其是PTS果糖摄取载体，而其不具有任何非PTS果糖摄取载体。经由FruA蛋白摄取到细胞中的果糖同时被磷酸化为果糖-1-磷酸。同时，非PTS果糖摄取载体的实例包括FucP蛋白。FucP蛋白称为L-岩藻糖通透酶，其是一种岩藻糖摄取载体，且其也具有果糖摄取活性(非专利文件2)。经由FucP蛋白摄取到细胞中的果糖不被磷酸化。存在于细胞中的果糖可以例如由果糖激酶磷酸化为果糖-6-磷酸，然后被利用(非专利文件3)。现有技术参考文献专利文件：专利文件1：WO2006/016705专利文件2：WO2006/070944非专利文件非专利文件1：Akashi,K.etal.,AminoAcidFermentation.JapanScientificSocietiesPress,p.195to215,1986。非专利文件2：KornbergH,andLourencoC.,ArouteforfructoseutilizationbyEscherichiacoliinvolvingthefucoseregulon.ProcNatlAcadSciUSA.2006Dec19；103(51):19496-9。非专利文件3：CaescuCI.etal.,Bifidobacteriumlongumrequiresafructokinase(Frk；ATP:D-fructose6-phosphotransferase,EC2.7.1.4)forfructosecatabolism.JBacteriol.2004Oct；186(19):6515-25。专利技术简述本专利技术实现的目标本专利技术的目标是开发用于改善细菌的L-氨基酸生产能力的新的技术，并从而提供有效生产L-氨基酸的方法。实现目标的手段为了实现上述目标，本专利技术的专利技术人进行了多项研究。作为结果，他们发现通过将细菌修饰成编码非PTS果糖摄取载体的基因和编码果糖激酶的基因的表达增加，能够改善当使用果糖作为碳源时细菌的L-氨基酸生产能力，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术可以例如如下实施。[1]生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：在含有果糖的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌以在所述培养基和/或所述细菌的细胞中积累L-氨基酸；和从所述培养基和/或所述细胞收集所述L-氨基酸，其中所述细菌以使非PTS果糖摄取载体的活性和果糖激酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了修饰。[2]上述方法，其中所述非PTS果糖摄取载体是由fucP基因编码的蛋白质。[3]上述方法，其中所述果糖激酶是由frk基因编码的蛋白质。[4]上述方法，其中所述fucP基因是编码下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的基因：(a)包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有非PTS果糖摄取活性的蛋白质；(c)包含与SEQIDNO:27或29的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有非PTS果糖摄取活性的蛋白质。[5]上述方法，其中所述frk基因是编码下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的基因：(a)包含SEQIDNO:31、33或35的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含SEQIDNO:31、33或35的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有果糖激酶活性的蛋白质；(c)包含与SEQIDNO:31、33或35的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有果糖激酶活性的蛋白质。[6]上述方法，其中通过增加编码所述非PTS果糖摄取载体的基因和编码所述果糖激酶的基因的表达来增加所述非PTS果糖摄取载体的活性和果糖激酶的活性。[7]上述方法，其中通过增加各个基因的拷贝数和/或修饰各个基因的表达控制序列来增加各个基因的表达。[8]上述方法，其中所述细菌以使磷酸转酮酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步的修饰。[9]上述方法，其中所述磷酸转酮酶由D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶组成。[10]上述方法，其中通过增加编码所述磷酸转酮酶的基因的表达来增加所述磷酸转酮酶的活性。[11]上述方法，其中所述细菌是棒状杆菌细菌或属于肠杆菌科的细菌。[12]上述方法，其中所述细菌是属于棒状杆菌属的细菌。[13]上述方法，其中所述细菌是谷氨酸棒状杆菌。[14]上述方法，其中所述细菌是属于泛菌属或埃希氏菌属的细菌。[15]上述方法，其中所述细菌是菠萝泛菌或大肠杆菌。[16]上述方法，其中所述L-氨基酸是谷氨酸家族的L-氨基酸。[17]上述方法，其中所述谷氨酸家族的L-氨基酸由选自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的一种或多种L-氨基酸组成。[18]上述方法，其中所述谷氨酸家族的L-氨基酸是L-谷氨酸。[19]上述方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单钠。[20]上述方法，其中所述细菌以使α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性与非修饰菌株相比降低的方式进行了进一步的修饰。[21]上述方法，其中所述细菌是棒状杆菌细菌，且其中所述细菌以使保持突变体yggB基因的方式进行了进一步的修饰。[22]上述方法，其中所述突变体yggB基因是具有以下突变的yggB基因，所述突变能改善所述棒状杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力。[23]上述方法，其中所述突变体yggB基因是具有下述(1)、(2)或(3)中定义的突变的yggB基因：(1)编码在野生型YggB蛋白质的位置419至533处的氨基酸残基的区域中的突变，(2)编码在野生型YggB蛋白质的跨膜区的区域中的突变，和(3)其组合。[24]上述方法，其中所述野生型YggB蛋白质是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：(a)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有以下性质的蛋白质，所述性质为所述蛋白质在所述棒状杆菌细菌中表达的增加提供所述棒状杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力的改善；(c)包含与SEQIDNO:10的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质具有其在所述棒状杆菌细菌中的得到增加的表达能够提供得到改善的所述棒状杆菌细菌的L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产L‑氨基酸的方法，所述方法包括：在含有果糖的培养基中培养具有L‑氨基酸生产能力的细菌以在所述培养基和/或所述细菌的细胞中积累L‑氨基酸；和从所述培养基和/或所述细胞收集所述L‑氨基酸，其中所述细菌以使非PTS果糖摄取载体的活性和果糖激酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了修饰。

【技术特征摘要】
2017.04.03 JP 2017-0739371.生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：在含有果糖的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌以在所述培养基和/或所述细菌的细胞中积累L-氨基酸；和从所述培养基和/或所述细胞收集所述L-氨基酸，其中所述细菌以使非PTS果糖摄取载体的活性和果糖激酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了修饰。2.根据权利要求1的方法，其中所述非PTS果糖摄取载体是由fucP基因编码的蛋白质。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述果糖激酶是由frk基因编码的蛋白质。4.根据权利要求2或3的方法，其中所述fucP基因是编码下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的基因：(a)包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有非PTS果糖摄取活性的蛋白质；(c)包含与SEQIDNO:27或29的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有非PTS果糖摄取活性的蛋白质。5.根据权利要求3或4的方法，其中所述frk基因是编码下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的基因：(a)包含SEQIDNO:31、33或35的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含SEQIDNO:31、33或35的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有果糖激酶活性的蛋白质；(c)包含与SEQIDNO:31、33或35的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有果糖激酶活性的蛋白质。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中通过增加编码所述非PTS果糖摄取载体的基因和编码所述果糖激酶的基因的表达来增加所述非PTS果糖摄取载体的活性和果糖激酶的活性。7.根据权利要求6的方法，其中通过增加各个基因的拷贝数和/或修饰各个基因的表达控制序列来增加各个基因的表达。8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述细菌以使磷酸转酮酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步的修饰。9.根据权利要求8的方法，其中所述磷酸转酮酶由D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶组成。10.根据权利要求8或9的方法，其中通过增加编码所述磷酸转酮酶的基因的表达来增加所述磷酸转酮酶的活性。11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述细菌是棒状杆菌细菌或属于肠杆菌科的细菌。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：横田康介，林和之，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP