The invention discloses an early detection method for colorectal cancer based on the methylation sequence of the NDRG4 gene, which assists in the diagnosis of early colorectal cancer by detecting whether a methylation sequence of the promoter region of the NDRG4 gene occurs, and the detection method is to extract DNA from tissue and fecal samples, which is processed by bisulfite. Real-time quantitative PCR assay, by calculating the target gene NDRG4 and the reference gene B2M amplified CT ratio difference is within the critical value to determine the level of methylation; this detection method is non-invasive, can be used for early colorectal cancer diagnosis.
【技术实现步骤摘要】
基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法
本专利技术涉及生物技术及疾病检测领域，特别是一种基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法。
技术介绍
结直肠癌(ColorectalCancer，CRC)是全球第四大男性常见癌症，是全球第三大女性常见癌症，在发达国家的发病率最高。CRC影响约5％的美国人群，在癌症相关死亡率中排名第二。近年来，随着我国人民生活水平的提高，生活习惯与饮食结构的改变，环境污染日益严重，我国结直肠癌的发病率不断增加。国家癌症早诊早治项目专家委员会2013年的研究报告指出，我国40岁以上的高危人群患进展期腺瘤和早期肠癌的比率为6％。据2015年《中国肿瘤登记年报》统计，结直肠癌的发病率近年来仍在增长。目前我国每年新增结直肠癌确诊病例44万，每年死亡患者多达23万人。结直肠癌主要包括结肠癌与直肠癌两大类，其发展是一个渐进过程：增生>小腺瘤>大腺瘤>重度非典型增生>早期腺癌>晚期腺瘤。大多数肠癌形成之前以息肉(异常突起)或腺瘤(腺上皮良性肿瘤)的形式在发病部位缓慢...
【技术保护点】
1.基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，其特征在于，NDRG4基因的甲基化序列如下：TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGG...
【技术特征摘要】
1.基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，其特征在于，NDRG4基因的甲基化序列如下：TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC；mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；诊断方法包括如下步骤：步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；步骤二，设计NDRG4基因的甲基化序列的引物和探针；步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：SEQIDNO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；步骤五，结果判定：自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，且目标基因FAM信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定的阈值线；根据待测样本的定量PCR检测信号，达到设定阈值线所需的循环次数，得到Ct值；若△Ct＝NDRG4目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值≤临界值，则该样本为发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；若△Ct＝NDRG4目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值>临界值，则该样本为未发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；所述临界值为NDRG4基因检测体系检测浓度为5ng/μL的1％比例甲基化参考品对应的△Ct值。2.基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，其特征在于，NDRG4基因的甲基化序列如下：TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC；mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；诊断方法包括如下步骤：步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；步骤二，设计NDRG4基因甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控；内部质控，以B2M基因作为内参基因，碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NG_012920.1第3886到4010位，对应的序列CG以外序列中C转换成T；针对这段转换的序列设计内控引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系NTC没有明显的扩增曲线，若样本有明显的扩增曲线，则判断为正常；步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：SEQIDNO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；步骤五，先判断样本是否符合要求，若阳性质控体系的目标基因NDRG4对应的FAM信号有明显的扩增曲线，内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线的Ct值的差值，即△Ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；若阴性质控体系的FAM无扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值的差值，即△Ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为未甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；所述临界值为NDRG4基因检测体系检测浓度为5ng/μL的1％比例甲基化参考品对应的△Ct值。3.根据权利要求1或2所述的基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，其特征在于，所述临界值为9。4.根据权利要求1所述的基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，其特征在于，步骤一，从组织样本中提取基因组DNA：采用TaKaRaMiniBESTFFPEDNAExtractionKit从FFPE样本中提取基因组DNA；具体步骤如下：用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，去除多余的石蜡；将石蜡切片组织放入1.5mL的离心管中，加入500μLBufferDP，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μLBufferGL，涡旋震荡；然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相，向下层水相中加入20μLProteinaseK，20mg/mL和10μLRNase，10mg/mL，吸打混匀，然后56℃水浴1小时；将处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温；将处理的样品加入200μLBufferGB和200μL100％乙醇，涡旋震荡10秒；然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相；将SpinColumn安置于CollectionTube上，将样品的下层水相溶液移至SpinColumn中，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液；将500μL的BufferWA加至SpinColumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；将500μL的BufferWB加至SpinColumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；将500μL的BufferWB加至SpinColumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液，将500μL的BufferWB加至SpinColumn中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；将SpinColumn安置于CollectionTube上，12000rpm室温离心2分钟；将SpinColumn安置于新的1.5mL离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50-100μL灭菌水或者ElutionBuffer，室温静置5分钟；12000rpm室温离心2分钟，洗脱DNA；将离心得到的DNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度；将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱，备用。5.根据权利要求1所述的基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，其特征在于，步骤一，从粪便样本中提取基因组DNA的具体步骤包括如下内容；取粪便样本4-6g加入裂解液40mL，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时；孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动；移取9mL上清液于新的50mL离心管中，再分别加入1mL提取辅佐液、60μL磁珠液和...
【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，李存耀，郑伟贤，杨蛟，刘刚，吕宁，陈一友，
申请(专利权)人：杭州诺辉健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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