一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法，该凝胶由包含丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris‑HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺的分离胶和浓缩胶组成。本发明专利技术通过加入甘氨酸等试剂，成功提高了聚丙烯酰胺凝胶电泳条带的锐利度及稳定性，在室温条件下可以保存长达一年的时间，不影响蛋白电泳的效果。同时，本发明专利技术的产品可以兼容常规的经济型的TRIS‑Glycine体系，不需要单独再购买昂贵的配套试剂，使用成本比较低廉。本发明专利技术的产品可以在高电压的条件下完成电压，最高可以达到200V电压，在30分钟就可以完成实验，缩短了电泳的时间。

【技术实现步骤摘要】
一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法
本专利技术属于生物医药及科研服务领域，具体涉及一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。
技术介绍
聚丙烯酰胺凝胶电泳，polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳体系有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。蛋白质印迹法（免疫印迹试验），即WesternBlot，是蛋白检测中一种最常用和最重要的方法之一，是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。整个蛋白质印迹实验是一个连续，系统性的过程，完整的步骤涉及如下：1.蛋白质的样品制备;2.蛋白质的定量；3.PAGE电泳；4.转膜；5.非特异性封闭；6.免疫杂交反应；7.化学发光显影及定影。其中每一个步骤对最终的结果都很重要，只有在进行每个实验都不出差错，才能保证获得预期的结果。其中每个实验步骤都会需要到一系列试剂辅助才能完成，因此，简单高效的试剂是必不可少的。PAGE电泳体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由过硫酸铵和四甲基乙二胺催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。常规的制备PAGE胶是将丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，Tris-HCl，过硫酸铵，SDS，四甲基乙二胺和双蒸水按一定的比例配置，要先配置完分离胶待凝固之后，再配置浓缩胶，插上梳子才完成PAGE胶制备过程。该过程配胶要计算一定的比例，等待凝胶凝固需要时间，此外由于传统凝胶的特点是不能长时间保存，一般在一周之内要用完，因此导致要经常配置PAGE胶，这需要大量的时间和精力，不利于蛋白研究的快速进行。虽然目前市场上也有公司研制出了可长时间保存的PAGE预制胶产品，但是他们的产品均需要特定的缓冲液体系，如MOPS缓冲液，而与常规的经济型的TRIS-Glycine体系却无法兼容，因此导致使用的成本很高，也不利于广泛的推广使用。
技术实现思路
针对上述常规PAGE胶的缺点，本专利技术旨在提供一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，由分离胶和浓缩胶组合而成；所述分离胶中包含的组分有丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris-HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺；所述浓缩胶中所包含的组分有丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris-HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺。进一步的，所述分离胶中，丙烯酰胺的质量为80-120g，双甲叉丙烯酰胺的质量为2.4-3.6g，甘氨酸的质量为25g，pH稳定剂HEPES的质量为5g，十二烷基硫酸钠的质量为0.5g，牛磺酸的质量为10g，超纯水的的体积为600mL，Tris-HCl溶液的体积为100mL，过硫酸铵溶液的体积为10mL，四甲基乙二胺0.5mL。进一步的，所述浓缩胶中，丙烯酰胺的质量为50g，双甲叉丙烯酰胺的质量为1.5g，甘氨酸的质量为25g，pH稳定剂HEPES的质量为5g，十二烷基硫酸钠的质量为0.5g，牛磺酸的质量为10g，超纯水的的体积为600mL，Tris-HCl溶液的体积为100mL，过硫酸铵溶液的体积为10mL，四甲基乙二胺0.5mL。进一步的，所述分离胶和所述浓缩胶中的Tris-HCl溶液均为1MpH6.5的Tris-HCl溶液。进一步的，所述分离胶和所述浓缩胶中的过硫酸铵溶液均为10%的过硫酸铵溶液。一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括如下步骤：步骤1）称取一定量的丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸，置于1000ml烧杯中；步骤2）向上一步骤的烧杯中加入一定量的超纯水，充分搅拌混匀，形成混合溶液；步骤3）在上一步骤得到混合溶液中，加入一定量的Tris-HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺，充分搅拌混匀，配置成分离胶溶液；步骤4）将上一步骤得到分离胶溶液加入到1.0mm的垂直制胶玻璃板中，加入适量的超纯水进行压线，静置一定时间待其凝固，形成分离胶；步骤5）再次称取一定量的丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸，置于另一个1000ml烧杯中；步骤6）向上一步骤的烧杯中加入一定量的超纯水，充分搅拌混匀，形成混合溶液；步骤7）在上一步骤得到混合溶液中，加入一定量的Tris-HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺，充分搅拌混匀，配置成浓缩胶溶液；步骤8）去除分离胶上方压线的超纯水，并用吸水纸吸干残留的液体，加入上一步骤刚配好的浓缩胶溶液，然后插入梳子，静置一定时间等待凝胶，制成聚丙烯酰胺凝胶。进一步的，步骤1）中，称取80-120g丙烯酰胺，2.4-3.6g双甲叉丙烯酰胺，25g甘氨酸，5gpH稳定剂HEPES，0.5g十二烷基硫酸钠，10g牛磺酸。进一步的，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：由分离胶和浓缩胶组合而成；所述分离胶中包含的组分有丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris‑HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺；所述浓缩胶中所包含的组分有丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris‑HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺。

【技术特征摘要】
1.一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：由分离胶和浓缩胶组合而成；所述分离胶中包含的组分有丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris-HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺；所述浓缩胶中所包含的组分有丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳定剂HEPES、十二烷基硫酸钠、牛磺酸、超纯水、Tris-HCl溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺。2.根据权利要求1所述的高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：所述分离胶中，丙烯酰胺的质量为80-120g，双甲叉丙烯酰胺的质量为2.4-3.6g，甘氨酸的质量为25g，pH稳定剂HEPES的质量为5g，十二烷基硫酸钠的质量为0.5g，牛磺酸的质量为10g，超纯水的的体积为600mL，Tris-HCl溶液的体积为100mL，过硫酸铵溶液的体积为10mL，四甲基乙二胺0.5mL。3.根据权利要求1所述的高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：所述浓缩胶中，丙烯酰胺的质量为50g，双甲叉丙烯酰胺的质量为1.5g，甘氨酸的质量为25g，pH稳定剂HEPES的质量为5g，十二烷基硫酸钠的质量为0.5g，牛磺酸的质量为10g，超纯水的的体积为600mL，Tris-HCl溶液的体积为100mL，过硫酸铵溶液的体积为10mL，四甲基乙二胺0.5mL。4.根据权利要求2或3所述的高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：所述分离胶和所述浓缩胶中的Tris-HCl溶液均为1MpH6.5的Tris-HCl溶液。5.根据权利要求2或3所述的高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：所述分离胶和所述浓缩胶中的过硫酸铵溶液均为10%的过硫酸铵溶液。6.一种高效稳定的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1）称取一定量的丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、pH稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，谢慧慧，
申请(专利权)人：苏州勇泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32