一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法技术

本发明专利技术涉及一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，属于生物化学实验技术领域，包括安装凝胶盘、琼脂糖凝胶的制备、灌胶、加样、观察等步骤，使用新型核酸染色GelRed试剂(Biotium)，取消EB染色步骤，操作简便易掌握、实验结果条带清晰，实验过程试剂无毒、低致突变性，提高了胶带染色效果和时间效率，同时保证操作人员的健康和实验环境的安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法
本专利技术属于生物化学实验
，具体涉及一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法。
技术介绍
近年来，分子生物学得到迅猛发展，聚合酶链式反应(PCR)是一种简便、准确的核酸定量检测技术。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法，是分子生物学的核心技术之一。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具有亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EthidiumBromide,EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组的目的。EB是实验室最常用的核酸染料，能使凝胶中的DNA和RNA很好地着色，从而显示凝胶中核酸的位置。但其具有毒性强、强致突变性、中度致癌性、难以降解转化和净化处理繁琐，对实验者和周围环境都有着较大的危害。
技术实现思路
为了克服
技术介绍
中的技术问题，本专利技术提出一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其将新型核酸染料GelRed试剂(Biotium)与3×稀释凝胶加样缓冲液按1:3000～5000比例配成混合液添加至PCR扩增产物中，实现核酸电泳与染色同时进行，从而取消传统核酸电泳过程的PCR扩增产物染色这一过程，但是却更有利于观察。一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，包括以下步骤：步骤1安装凝胶盘，包括：将量筒、三角瓶、凝胶盘以及齿试样格洗净并晾干；将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封；将凝胶盘置于水平桌面上，并插上齿试样格；步骤2琼脂糖凝胶的制备，包括制备用量筒量取5×TBE电泳缓冲液40mL加水至200mL，配置1×TBE稀释电泳缓冲液并倒入三角瓶中；称取1g-4gInvitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％-2％浓度琼脂糖胶液，盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；将三角瓶放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间1min；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间为90s；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，直至有大气泡产生时停止，继续放入微波炉，直至琼脂糖完全溶解；步骤3灌胶，包括将磁力搅拌子放入三角瓶中，并将三角瓶置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却；待三角瓶内的琼脂糖溶液温度冷却至50℃-60℃，将琼脂糖溶液缓慢地倒入凝胶盘中，以免产生气泡；在每份10μLDNA样品PCR扩增产物中加入5μLGelRed试剂(Biotium)与3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液，放置待用；其中3×稀释凝胶加样缓冲液和GelRed试剂按3000～5000:1比例进行混合；将电泳槽置于水平桌面上，并调整至水平状态，加入2000mL1×TBE稀释电泳缓冲液于电泳槽内；45-60分钟待凝胶凝固后，撕开胶带密封纸，将凝胶盘转移到电泳槽中，拔出齿试样格，并将齿试样格洗净；步骤4加样，包括吸取3μLDNA样品PCR扩增产物、GelRed和3×凝胶加样缓冲液的混合液加入胶孔中，在待测样品左侧的样品孔中加入3μL的DNA分子量标记，用作分子量参照；步骤5电泳，包括盖上电泳槽的盖子，接上电源连接线，打开电泳仪的电源开关，将按钮调到“打开”状态以及“电压”模式，选择电压100V；将“电压”档调整至0V，再将按钮调到“关闭”的状态，并关闭电源开关；步骤6观察，包括打开电脑中的成像软件，接上凝胶成像系统的电源；戴上手套，将凝胶盘转移到紫外灯台上，取下手套，关闭成像系统的门；打开紫外灯的开关，选择成像软件“菜单”下的“预览”功能，调整曝光时间，单击“拍照”按钮，获取图像，并保存；关闭紫外灯的开关，断开凝胶成像系统的电源，打开成像系统的门；戴上手套，从凝胶盘中将凝胶取出，弃于垃圾袋中，用吸水纸将紫外灯搽拭干净，取下手套；关上成像系统的门，关闭电脑。进一步的优选技术方案是，所述的步骤2琼脂糖凝胶的制备中从微波炉中取出三角瓶时需戴上防护手套。进一步的优选技术方案是，所述的步骤3灌胶中磁力搅拌机搅拌的搅拌速度为300r/min-500r/min，以避免产生气泡。进一步的优选技术方案是，所述的步骤3灌胶中1xTBE稀释缓冲液需浸没凝胶表面约1～2mm。本专利技术的有益效果：本专利技术将新型核酸染料GelRed试剂添加至PCR扩增产物中，实现核酸电泳与染色同时进行，从而取消传统核酸电泳过程的PCR扩增产物染色的步骤，并且更有利于观察。附图说明图1为使用本专利技术方法的凝胶电泳图；图2为传统使用EB染色的凝胶电泳图；图3为采用改进的EB染色方法检测核酸琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的技术方案、目的、有益效果更加清楚，下面将结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1.如图1所示，为采用本专利技术方法提取的凝胶电泳图。一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其包括：将量筒、三角瓶、凝胶盘、齿试样格洗净后并晾干，将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封，并将凝胶盘置于水平桌面上，插上齿试样格，量筒用于量取TBE电泳缓冲液。由于齿试样格一边平口，一边凹口，与凝胶盘是互补设计，插入时，需要注意左右方向。琼脂糖凝胶的制备用量筒量取5×TBE电泳缓冲液40mL加水至200mL，配置1×TBE稀释电泳缓冲液并倒入三角瓶中；称取1g-4gInvitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％-2％浓度琼脂糖胶液；盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；将三角瓶放入微波炉中，调到微波炉档位至中高火(功率约为80W)，设定时间1min，使用防护手套取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，再次将档位调到中高火，设定时间90s。再次使用防护手套取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，待至有大气泡产生时，粉末已完全溶解；为确保琼脂糖完全溶解，需再次放入微波炉中加热直至完全溶解。将磁力搅拌子放入三角瓶中，置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却，磁力搅拌机搅拌的搅拌速度为300r/min-500r/min。在磁力搅拌机上的转速不要过大，以免产生很多气泡。冷却至50℃-60℃，将琼脂糖溶液缓慢倒入凝胶盘中，冷却后的琼脂糖溶液温度不能过高，也不能过低，置于手上，感觉微热，但不烫手即可。在每份10μLDNA样品PCR扩增产物中加入5μLGelRed试剂(Biotium)与3×稀释加样缓冲液的混合液，放置待用，将电泳槽置于水平桌面上，并调整至水平状态，加入2000mL1×TBE稀释电泳缓冲液，约1小时后，待凝胶凝固，撕开胶带纸，将凝胶盘转移到电泳槽中，拔出齿试样格，洗净，TBE缓冲液需浸没凝胶表面1-2mm。吸取3uLDNA样品PCR扩增产物、GelRed试剂和3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液加入样品孔中，在待测样品左侧的凝胶盘胶孔中加入3uL的DNA分子量标记，用以作分子量参照。盖上电泳槽的盖子，接上电源连接线，电压选择100V，开始电泳，电泳完毕后，先将电压降到0V，再将按钮调到“关闭”的状态，最后关闭电源开关。打开电脑中的成像软件，接上凝胶成像系统的电源。戴上手套，将凝胶转移到紫外灯台上，取下手套，关上成像系统的门，此时不能戴上手套接触电脑和凝胶成像系统。打开紫外灯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1安装凝胶盘，包括：a.将量筒、三角瓶、凝胶盘以及齿试样格洗净并晾干；b.将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封；c.将凝胶盘置于水平桌面上，并插上齿试样格；步骤2琼脂糖凝胶的制备，包括配置新鲜5×TBE电泳缓冲液母液：称取54g Tris碱和27.5g硼酸，再量取20mL已配置的0.5M EDTA溶液，最后用去离子水定容至1000mL，待用；配置6×凝胶加样缓冲液：分别称取25mg溴酚蓝、25mg二甲苯青FF和4g蔗糖，最后用去离子水定容至10mL，待用；用量筒量取5×TBE电泳缓冲液40mL加水至200mL，配制1×TBE稀释缓冲液并倒入三角瓶中；称取1g‑4g Invitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％‑2％浓度琼脂糖胶液，盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；将三角瓶放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间1min；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间为90s；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，直至有大气泡产生时停止，继续放入微波炉，直至琼脂糖完全溶解；步骤3灌胶，包括a.将磁力搅拌子放入三角瓶中，并将三角瓶置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却；b.待三角瓶内的琼脂糖溶液温度冷却至50℃‑60℃，将琼脂糖溶液缓慢地倒入凝胶盘中，以免产生气泡；c.在每份10μL DNA样品PCR中加入5μL GelRed试剂与3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液，放置待用；其中3×稀释凝胶加样缓冲液和GelRed染色液混合配比按3000～5000:1进行混合；d.将电泳槽置于水平桌面上，并调整至水平状态，加入2000mL的1×TBE稀释电泳缓冲液于电泳槽内；e.45‑60分钟待凝胶凝固后，撕开胶带密封纸，将凝胶盘转移到电泳槽中，拔出齿试样格，并将齿试样格洗净；步骤4加样，包括吸取3μL DNA样品PCR扩增产物、GelRed试剂和3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液加入琼脂糖胶胶孔中，在待测样品左侧的样品孔中加入3μL的DNA分子量标记，用作分子量参照；步骤5电泳，包括盖上电泳槽的盖子，接上电源连接线，打开电泳仪的电源开关，将按钮调到“打开”状态以及“电压”模式，选择电压100V；将“电压”档调整至0V，再将按钮调到“关闭”的状态，并关闭电源开关；步骤6观察，包括a.打开电脑中的成像软件，接上凝胶成像系统的电源；b.戴上手套，将凝胶盘转移到紫外灯台上，取下手套，关闭成像系统的门；c.打开紫外灯的开关，选择成像软件“菜单”下的“预览”功能，调整曝光时间，单击“拍照”按钮，获取图像，并保存；d.关闭紫外灯的开关，断开凝胶成像系统的电源，打开成像系统的门；e.戴上手套，从凝胶盘中将凝胶取出，弃于垃圾袋中，用吸水纸将紫外灯搽拭干净，取下手套；f.关上成像系统的门，关闭电脑。...

【技术特征摘要】
1.一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1安装凝胶盘，包括：a.将量筒、三角瓶、凝胶盘以及齿试样格洗净并晾干；b.将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封；c.将凝胶盘置于水平桌面上，并插上齿试样格；步骤2琼脂糖凝胶的制备，包括配置新鲜5×TBE电泳缓冲液母液：称取54gTris碱和27.5g硼酸，再量取20mL已配置的0.5MEDTA溶液，最后用去离子水定容至1000mL，待用；配置6×凝胶加样缓冲液：分别称取25mg溴酚蓝、25mg二甲苯青FF和4g蔗糖，最后用去离子水定容至10mL，待用；用量筒量取5×TBE电泳缓冲液40mL加水至200mL，配制1×TBE稀释缓冲液并倒入三角瓶中；称取1g-4gInvitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％-2％浓度琼脂糖胶液，盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；将三角瓶放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间1min；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间为90s；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，直至有大气泡产生时停止，继续放入微波炉，直至琼脂糖完全溶解；步骤3灌胶，包括a.将磁力搅拌子放入三角瓶中，并将三角瓶置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却；b.待三角瓶内的琼脂糖溶液温度冷却至50℃-60℃，将琼脂糖溶液缓慢地倒入凝胶盘中，以免产生气泡；c.在每份10μLDNA样品PCR中加入5μLGelRed试剂与3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液，放置待用；其中3×稀释凝胶加样缓冲液和GelRed染色液混合配比按3000～5000:1进行混合；d.将电泳槽置于水平桌面上，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡标林，吴小燕，李霞，罗世友，
申请(专利权)人：江西省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36