一种G2 EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法技术

本发明专利技术公开了一种G2 EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，该方法包括如下步骤：采用同位素稀释质谱方法以及氨基酸分析法对G2 EPSPS蛋白纯品的含量进行准确测定，最后采用重量法‑容量法配制出G2 EPSPS蛋白溶液标准物质，以ELISA法进行量值核验，并进行均匀性和稳定性检验，同时进行标准物质加入稳定剂后储存稳定性验证。本发明专利技术制备的G2 EPSPS蛋白标准物质对于检测抗草甘膦转基因作物中G2 EPSPS蛋白是否合理表达至关重要。本发明专利技术提供一种G2 EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，具有良好的可靠性、准确性、溯源性。

A calibration method for G2 EPSPS protein solution standard substance

The invention discloses a method for determining the standard material of G2 EPSPS protein solution. The method comprises the following steps: accurately determining the content of pure G2 EPSPS protein by isotope dilution mass spectrometry and amino acid analysis method, and finally preparing the standard material of G2 EPSPS protein solution by gravimetric method and volumetric method for ELISA. Methods Quantity test, homogeneity and stability test were carried out, and storage stability test was carried out after adding stabilizer to the standard material. The G2 EPSPS protein standard material prepared by the invention is very important for detecting the reasonable expression of G2 EPSPS protein in glyphosate-resistant transgenic crops. The invention provides a method for determining the reference material of G2 EPSPS protein solution, which has good reliability, accuracy and traceability.

【技术实现步骤摘要】
一种G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法。
技术介绍
自1996年以来，抗草甘膦作物已成为最重要的转基因作物。美国自1998年开始大面积种植抗草甘膦农作物，极大推动了抗草甘膦农作物在全球范围内的发展，并产生了巨大的经济效益。但另一方面，转基因作物花粉携带抗草甘膦在环境中漂移，可能导致抗草甘膦基因的扩散而产生超级杂草，造成环境的污染。因此制备G2EPSPS蛋白标准物质对于检测抗草甘膦转基因作物中G2EPSPS蛋白是否合理表达至关重要。对抗草甘膦转基因作物中的G2EPSPS蛋白进行定量检测，并保证检测的准确、可靠和有效性，需要计量标准的支撑。在保证抗草甘膦转基因作物检测结果的可比性、溯源性，推进抗草甘膦转基因作物检测方法标准化等方面，G2EPSPS蛋白标准物质发挥着十分重要的作用。本专利技术提供一种G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，具有良好的可靠性、准确性、溯源性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法。一种G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，包括如下步骤：(1)采用两种精确的蛋白质含量测定方法即同位素稀释质谱方法和氨基酸分析法对G2EPSPS蛋白纯品进行含量测定；(2)采用重量法-容量法根据已经进行含量测定的G2EPSPS蛋白纯品配制出G2EPSPS蛋白溶液标准物质，并采用ELISA法进行量值核验，进行均匀性稳定性检验。(3)配置的标准溶液中加入蛋白稳定剂，以保证蛋白标准物质的稳定储存所述步骤(1)中G2EPSPS蛋白溶液中加入的同浓度标记氨基酸混合溶液包括脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸。加入氨基酸混合液的G2EPSPS蛋白溶液在(110.0±0.5)℃的烘箱中进行水解，水解不同的时间后上机测定脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的相对比例进而确定合适水解时间为48h。另外氨基酸分析法过程中G2EPSPS蛋白溶液其水解条件与IDMS是相同的，不同的是测定时用国家氨基酸标准物质作为外标，采用柱前衍生化方法进行外标法定量，即分别在G2EPSPS蛋白质纯品水解液中以及苯丙氨酸标准品溶液中加入配置好的衍生剂异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液和三乙胺乙腈溶液在室温下放置50min左右，衍生结束后加入一定量正己烷溶液，静置10min，取下层溶液，对衍生后的水解液以及苯丙氨酸标准品溶液进行液相分析。此专利技术采用同位素稀释质谱法测定G2EPSPS蛋白纯品纯度的同时采用了氨基酸分析法对G2EPSPS蛋白纯品纯度进行了测定。所述步骤(2)中将同位素稀释质谱方法进行准确含量测定的G2EPSPS蛋白纯品采用重量法-容量法配制出G2EPSPS蛋白溶液标准物质，并用ELISA法进行量值核验。所述步骤(3)中蛋白稳定剂包括1.5％氨基酸，2.5％甘油，0.1％EDTA，0.01％叠氮化钠。本专利技术的有益效果：本专利技术的G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法是通过同位素稀释质谱法以及氨基酸分析法进行G2EPSPS蛋白纯品含量的测定，然后根据已经进行含量测定的G2EPSPS蛋白纯品，采用重量法-容量法配制出G2EPSPS蛋白溶液标准物质。同位素稀释质谱法和重量法-容量法这两种定值方法均是标准物质定值的基准方法(其特性值在不参考相同特性或量的其他标准的情况下被采纳，被指定或广泛公认具有国家最高计量学品质的测量方法)，保证了定值结果的准确性和溯源性，此外本专利技术在配置的标准物质中加入相应的稳定剂，保证了蛋白质的稳定保存。附图说明图1是G2EPSPS蛋白高效凝胶排阻色谱图。图2是G2EPSPS蛋白纯度芯片电泳测定结果。图3是G2EPSPS蛋白基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱图。图4是蛋白水解液提取离子流色谱图。图5是不同水解时间下氨基酸的相对比例。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实验采用如下所述的实验材料1.实验主要仪器Agilent2100生物芯片分析系统，安捷伦公司，美国；高效液相色谱仪，Agilent1200，安捷伦公司，美国；基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪，Ultraflex，布鲁克公司，美国；三重串联四级杆质谱仪，5500，AB公司，美国；涡旋混匀器：MS2型，德国IKA公司；掌上离心机：Mlnl-6K，中国珠海黑马公司；烘箱：UFE500，德国Memmert公司；移液器(10，20，100，200，1000ul)：法国Gilson公司；天平：ME235S型，感量0.01mg，德国Satorius公司；天平：UMX5型，感量0.1ug，德国Satorius公司；2.实验主要试剂G2蛋白溶液，由生物技术服务公司重组表达和纯化；Agilent2100蛋白质分析试剂盒，安捷伦公司，美国；超纯水，经MilliQ超纯水系统纯化，电阻率达到18.2MΩ·cm；乙腈，色谱纯，J.T.Baker,美国；三氟乙酸，分析纯，Sigma公司；CHCA基质，布鲁克公司，美国；全氟庚酸：Sigma-Aldirich公司，美国；盐酸：优级纯，北京化学试剂公司产品；脯氨酸：fluka公司，美国；缬氨酸：fluka公司，美国；苯丙氨酸：fluka公司，美国；苯丙氨酸标准物质：Sigma公司，美国；脯氨酸同位素标记物：美国剑桥同位素实验室；缬氨酸同位素标记物：美国剑桥同位素实验室；苯丙氨酸同位素标记物：美国剑桥同位素实验室；实施例1(一)标准物质原料基本理化性质的表征：(1)采用高效液相排阻色谱对G2EPSPS蛋白进行纯度的测定：从纯化好的G2转基因蛋白中取出7个子样，用含有0.1％TFA的水将样品稀释到1mg/mL，上机进行纯度分析，典型色谱图如图1所示。结果如表1所示，平均纯度为96.6％。表1G2EPSPS蛋白高效液相色谱纯度分析结果(％)分析次数1234567平均值纯度96.696.796.596.796.796.696.796.6(2)凝胶排阻色谱后采用芯片电泳对G2EPSPS蛋白的纯度进行分析，平行取5个G2蛋白子样进行分析，结果如图2所示，在50kD出可以观察到目的蛋白条带，其分子量与理论蛋白分子量一致(46.6kD)。(3)采用基质辅助激光诱导解吸飞行时间质谱仪对G2EPSPS蛋白分子量进行测定，即将G2蛋白用含有0.1％TFA的水溶液稀释成0.1mg/mL的溶液，与CHCA基质饱和溶液等比例混合后点在靶上，干燥后推入质谱仪中进行测定。G2EPSPS蛋白质谱图如图3，由图3可知50kD处可观察到G2转基因蛋白的主峰，25kD处为双电荷峰，34kD处为杂蛋白峰。平行分析7个样品分析，其结果如表2所示。表2G2EPSPS蛋白分子量测定结果(二)标准物质定值：标准物质的定值是对标准物质特性量值赋值的全过程，必须保证其量值的准确和溯源性。(1)同位素稀释质谱法测定G2EPSPS蛋白质纯品含量取G2EPSPS蛋白，在室温平衡1hr后打开样品管，将内装溶液混合均匀后转入离心管中，用新配制的0.1mol/L的盐酸将其配制成0.1mg/mL的溶液。取20μL稀释的G2转基因蛋白溶液，加入同浓度的标记氨基酸混合溶液，加入6mol/L的盐酸，通氮除氧后密封，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种G2 EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用两种精确的蛋白质含量测定方法，即同位素稀释质谱方法和氨基酸分析法对G2 EPSPS蛋白纯品进行含量测定；(2)采用重量法‑容量法根据已经进行含量测定的G2 EPSPS蛋白纯品配制出G2 EPSPS蛋白溶液标准物质，并采用ELISA法进行量值核验，进行均匀性稳定性检验；(3)配置的标准溶液中加入蛋白稳定剂，以保证蛋白标准物质的稳定储存。

【技术特征摘要】
1.一种G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用两种精确的蛋白质含量测定方法，即同位素稀释质谱方法和氨基酸分析法对G2EPSPS蛋白纯品进行含量测定；(2)采用重量法-容量法根据已经进行含量测定的G2EPSPS蛋白纯品配制出G2EPSPS蛋白溶液标准物质，并采用ELISA法进行量值核验，进行均匀性稳定性检验；(3)配置的标准溶液中加入蛋白稳定剂，以保证蛋白标准物质的稳定储存。2.根据权利要求1所述的G2EPSPS蛋白溶液标准物质定值方法，其特征在于，所述步骤(1)中同位素稀释质谱法的步骤为：(1)G2EPSPS蛋白溶液中加入的同浓度标记氨基酸混合溶液，氨基酸包括脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸；(2)加入氨基酸混合液的G2EPSPS蛋白溶液在(110.0±0.5)℃的烘箱中进行水解，水解后上机测定脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的相对比例，确定水解时间为48h；(3)另外...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亮，金芜军，林敏，宛煜嵩，刘卫晓，武利庆，刘刚，柳方方，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11