一种当归蛋白在制备防护肝损伤药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及天然中药蛋白领域，更具体地涉及一种当归蛋白在制备防护急性肝损伤药物中的应用，所述当归蛋白N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA。所述当归蛋白对正常肝细胞L‑02具有显著的促增殖作用，在0.5 mg/mL的剂量下，可使L‑02细胞的增殖率达到163.14%。所述当归蛋白用于制备预防肝损伤药物，可显著提高损伤鼠肝脏CAT、GST和T‑AOC活力极显著地减轻肝脏MDA水平，显著改善损伤鼠肝脏的肝细胞坏死状况，进而显著降低损伤鼠血液ALT、AST活力及肝脏指数，使之基本恢复至正常组水平，从而显著减轻CCl4对小鼠肝脏的损伤。

Application of a Chinese angelica protein in the preparation of protective liver injury drugs

The invention relates to the field of natural Chinese medicine protein, and more specifically relates to the application of Angelica protein in the preparation of drugs for protecting acute liver injury. The N-terminal sequence of Angelica protein is GIQKTEVEAPSTVSA. The Angelica sinensis protein can significantly promote the proliferation of normal hepatocyte L_02. At the dose of 0.5 mg/mL, the proliferation rate of L_02 cells can reach 163.14%. The Angelica sinensis protein can significantly increase the activities of CAT, GST and T_AOC in the liver of the injured rats, significantly reduce the level of MDA in the liver, significantly improve the necrosis of hepatocytes in the liver of the injured rats, and then significantly reduce the activities of ALT, AST and liver index in the blood of the injured rats, and basically restore the normal group water. Therefore, CCl4 can significantly reduce the liver damage in mice.

【技术实现步骤摘要】
一种当归蛋白在制备防护肝损伤药物中的应用
本专利技术涉及天然中药蛋白领域，更具体地涉及一种当归蛋白在制备防护肝损伤药物中的应用。
技术介绍
肝脏是人体内最重要的器官之一，负责内源性和外源性物质的代谢、分泌、储存和解毒。目前，在全球范围内，肝病仍然是公共卫生面临的主要威胁之一。化学性肝损伤是指化学性肝毒性物质包括酒精、环境中的化学有毒物质及某些药物（例如化疗药等）所造成的肝损伤，若没有及时治疗将会对肝脏造成不可逆转的伤害，严重的将导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。尽管现代医学取得了巨大的进展，从一些植物中获得了多种具有保肝作用的化合物，但是还没有完全有效的药物可以提供对器官的完全保护，或者帮助肝细胞再生。因此，人们一直在寻找高效安全的保肝物质。当归[Angelicasinensis（Oliv.）Diels]是伞形科当归属的一种多年生草本植物。当归是用于治疗贫血、便秘、心血管疾病和肝纤维化的中药（TCM）中最受欢迎的植物之一，已被使用数千年。当归总蛋白具有清除DPPH自由基能力，且既能极显著促进正常肝细胞L-02的增殖（P<0.01），又能极显著抑制白血病细胞K562的增殖（P<0.01）。本专利技术从中药当归中得到当归PR-10家族蛋白——ASPR。病程相关蛋白-10家族（PR-10）蛋白广泛分布于各种属以及植物各器官中，属于植物抗逆蛋白，与植物抵抗生物胁迫（病原体）与非生物胁迫（干旱，热量，寒冷和盐分）的能力有关。本专利技术提供了当归蛋白ASPR的制备方法及其在预防肝损伤的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种当归蛋白在制备防护肝损伤药物中的应用，以开发新型肝损伤防护剂。本专利技术采取的技术方案如下：所述当归蛋白的制备方法为：以10倍体积0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）浸泡当归饮片，4℃抽提过夜，次日用4层纱布过滤残渣，滤液于12000rpm、4℃离心10min，收集上清。将所得的上清进行80%硫酸铵沉淀，收集沉淀，溶于2倍体积的0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）中，经SephadexG-50层析柱分离，收集第二个洗脱峰，即为目的蛋白ASPR，分子量为18.33kDa，经过序列测定，N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA。所述当归蛋白可用于制备预防肝损伤的药物。所述当归蛋白的使用浓度为0.5-2mg/mL；将无菌过滤过的当归ASPR蛋白以无菌的PBS或生理盐水稀释至使用浓度。使用方法为连续肌肉注射或静脉注射当归ASPR蛋白3d，每次0.5mL。本专利技术的优点在于：（1）本专利技术首次将当归ASPR蛋白用于预防肝损伤模型。（2）本专利技术证实当归ASPR蛋白对正常肝细胞L-02具有显著的促增殖作用，在0.5mg/mL的剂量下，可使L-02细胞的增殖率达到163.14%。（3）本专利技术证实当归ASPR蛋白对CCl4诱导的小鼠的急性肝损伤具有预防作用，该蛋白可显著提高损伤鼠肝脏CAT、GST和T-AOC活力，极显著地减轻肝脏MDA水平，显著改善损伤鼠肝脏的肝细胞坏死状况，进而显著降低损伤鼠血液ALT、AST活力及肝脏指数，使之基本恢复至正常组水平，从而显著减轻CCl4对小鼠肝脏的损伤。本专利技术药物的具体用途：（1）可用于预防因外在因素造成急性肝损伤患者，如病毒感染、用药不当、食物添加剂、化疗药副作用、乙醇摄入过多及接触、食入有毒食物等。（2）可用于预防因环境因素造成各种肝损伤，如高脂肪饮食（HFD）和久坐不动的生活方式。本专利技术药物的药理作用：本专利技术的当归ASPR蛋白可显著提高损伤鼠肝脏CAT、GST和T-AOC活力极显著地减轻肝脏MDA水平，显著改善损伤鼠肝脏的肝细胞坏死状况，进而显著降低损伤鼠血液ALT和AST活力及肝脏指数，使之基本恢复至正常组水平，从而显著减轻CCl4对小鼠肝脏的损伤。附图说明图1当归ASPR蛋白SDS-PAGE，M：蛋白Marker1：当归蛋白（ASPR）。图2当归ASPR蛋白对L-02细胞的增殖效应。图3不同剂量当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠血浆ALT的影响；n=5,与正常组相比,**P<0.01,与肝损伤组相比,#P<0.05。图4当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠肝脏指数的影响；n=8,与正常组相比,*P<0.05,与肝损伤组相比,#P<0.05。图5当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响；n=8,与正常组相比,**P<0.01,与肝损伤组相比，##P<0.01。图6当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠肝脏表观学及组织学特征的影响n=8。图7当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠MDA水平的影响；n=8,与正常组相比,*P<0.05,与肝损伤组相比,#P<0.05。图8当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠CAT活力水平的影响；n=8,与正常组相比,*P<0.05,与肝损伤组相比,#P<0.05。图9当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠GST活力水平的影响；n=8,与正常组相比,**P<0.01,与肝损伤组相比,##P<0.01。图10当归ASPR蛋白对肝损伤小鼠T-AOC活性的影响；n=8,与正常组相比,*P<0.05，与肝损伤组相比,#P<0.05。具体实施方式实施例1:当归ASPR蛋白的纯化以10倍体积0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）浸泡切成小块的当归，4℃静置过夜，约15h，次日用4层纱布过滤残渣，滤液于12000rpm、4℃离心10min，所得的上清为当归蛋白粗提液；粗蛋白液进行硫酸铵一步沉淀（0-80%），沉淀过夜并收集其沉淀蛋白，溶于2倍体积的0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）中，将硫酸铵沉淀的溶解液上样于经平衡液（0.05mol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液）充分平衡后的SephadexG-50层析柱，用平衡液洗脱并收集第二个洗脱峰，经SDS-PAGE电泳检测纯度。实验结果：当归经粗提取、硫酸铵一步沉淀（0→80%）、SephadexG-50凝胶过滤层析最终得到SDS-PAGE上显示单一条带，分子量为18.33KDa的当归ASPR蛋白，如图1所示。该蛋白N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA，该蛋白分子量18.33kDa，为PR-10家族蛋白，命名为ASPR。实施例2：当归ASPR蛋白对L-02细胞的增殖效应采用MTT法检测当归ASPR蛋白对L-02细胞存活率的影响。根据下列公式计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（测定组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100。实验结果：当归ASPR蛋白能有效地促进L-02细胞增殖，且具有浓度依赖关系，如图2所示，浓度在0.063-0.50mg/mLL时，L-02细胞的存活率随浓度的增加而增加。而在0.5-0.625mg/mLL时，L-02细胞的存活率随浓度的增加而降低，且在0.5mg/mLL的剂量下，当归ASPR蛋白可使L-02的增殖率达到163.14%。实施例3：对CCl4诱导的急性肝损伤的预防作用的剂量摸索1、实验动物与分组雄性昆明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种当归蛋白在制备防护肝损伤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种当归蛋白在制备防护肝损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘剑茹，王香玲，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35