一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽制造技术

本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种对结肠癌细胞有靶向作用的多肽及其用途。该多肽为以下任意：（1）多肽的氨基酸序列为：YPEIWPTDHKLM（SEQ ID No.1）；（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。所述的多肽能够与结肠癌细胞特异性结合，而与正常的肠上皮细胞无特异性作用，而且作用效果明显，为临床治疗提供了可靠的科学依据。

A specific peptide targeting human colon cancer cells

The invention belongs to the field of biomedicine, in particular to a polypeptide having a targeting effect on colon cancer cells and its application. The polypeptide is any of the following: (1) the amino acid sequence of the polypeptide is YPEIWPTDHKLM (SEQ ID No.1); (2) a polypeptide derivative having the same biological function as (1) the polypeptide molecule described in (1) by deletion, insertion or replacement of one or more amino acids in the polypeptide molecule. The polypeptide can specifically bind to colon cancer cells, but has no specific effect on normal intestinal epithelial cells, and has obvious effect, thus providing a reliable scientific basis for clinical treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽及其用途。
技术介绍
结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率仅次于胃癌和食管癌。好发年龄一般在50岁以上，男性比女性多，男女之比为2:1。结肠癌的发病原因尚不明确，主要有环境因素、遗传因素、癌前疾病等。国内调查显示，早期结肠癌术后存活率达90-95%，但是在我国实际上超过80%的患者确诊时已发展到中晚期，早期诊断率仅为10-15%；而晚期结肠癌的存活率则仅仅为5%。因此，早期诊断、早期治疗，能明显改善结肠癌患者的愈后。结肠癌的早期症状多不为病人注意，就医时也常以“痢疾”、“肠炎”等病处理，一旦出现中毒症状或梗阻症状以及触及腹块时已非早期，因此，开发敏感诊断技术，从而做到早期诊断是研究重点之一。现有的抗癌药物通常具有毒副作用较大、药物用量大、容易产生后天耐药性等缺点，这会对患者的治疗造成影响。靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点的治疗方式。可设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合而发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗是癌症治疗的又一研究重点。噬菌体展示技术是分子生物学领域一种重要的筛选分子间相互作用的技术。噬菌体展示技术的主要原理是目的基因或编码蛋白质和多肽的基因通过基因工程技术克隆到噬菌体表面蛋白基因的适当位置上，让其随着噬菌体DNA的扩增而表达在噬菌体表面，由于外源基因和噬菌体基因的兼容性，外源基因的表达产物多肽或蛋白质仍可以保持其原有的空间结构和相应的生物学活性。然后，我们利用靶细胞对噬菌体进行减数筛选，最终从噬菌体多肽库中筛选出能够与靶细胞特异性结合的目的噬菌体，并对其DNA进行测序，即可得到相应多肽的编码序列。这一技术实现了蛋白质或多肽基因型和表现型之间的联系，并且具有操作简便，可以高通量检测的特点，从而成为筛选肿瘤细胞特异性结合肽的高效手段，为肿瘤的早期检测和药物治疗的靶向载体研究提供了新的方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种多肽，能特异性与结肠癌细胞靶向结合，而对正常肠上皮细胞没有影响，这在结肠癌的早期诊断和靶向药物的研发等方面具有重要作用。本实验即以人正常肠上皮HIEC细胞为对照，采用人源性结肠癌SW480细胞对噬菌体展示多肽库进行减数筛选，用蓝白筛选试验挑选出能够与结肠癌细胞发生特异性结合的阳性噬菌体克隆，并用ELISA实验验证噬菌体与结肠癌结合的特异性。然后以大肠杆菌为载体，扩增纯化噬菌体后提取其DNA进行测序，即得到能够与结肠癌发生特异性结合的多肽的编码序列，并人工合成荧光标记的阳性多肽，进行荧光标记-多肽与人结肠癌细胞结合作用的验证，进而为结肠癌的早期诊断和靶向治疗提供实验基础。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽，该多肽为以下任意（1）多肽的氨基酸序列为：YPEIWPTDHKLM（SEQIDNo.1），（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。该多肽对肿瘤细胞有靶向结合，与肿瘤细胞特异性结合。所述的肿瘤细胞为结肠癌细胞。所述多肽在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，该试剂盒中包含所述多肽或多肽偶联物。一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽在制备用于治疗结肠癌药物中的应用，该药物包含所述的多肽与药物活性成分，或包含所述的多肽与递药载体。该药物为任何药物治疗学上可接受的剂型，该药物优选的剂型为注射制剂。该药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。与现有技术相比，本专利技术的效果在于：本专利技术使用噬菌体展示技术具有操作简便、高通量的淘选、高效率，可以筛选模拟表位、展示多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接、重组噬菌体易于纯化等优点。我们运用使菌体展示技术所筛选出的多肽能够与结肠癌细胞特异性结合，而与正常的肠上皮细胞无特异性作用，而且作用效果明显，为临床治疗提供了可靠的科学依据。附图说明图1为ELISA鉴定1-20号阳性噬菌体克隆与人源性结肠癌SW480细胞亲和力的OD405结果图。图2为6号阳性噬菌体克隆与人正常肠上皮HIEC细胞和人源性结肠癌SW480细胞亲和力的细胞免疫荧光实验结果图。图3为6号阳性噬菌体测序结果图。图4为FITC-YM12与HIEC、SW480细胞靶向结合的细胞免疫荧光结果图。图5为FITC-YM12与HIEC、SW480细胞结合能力的流式细胞检测结果图。A为HIEC与PBS的结合能力结果图；B为HIEC与靶向多肽FITC-GV12的结合能力结果图；C为SW480与PBS的结合能力结果图；D为SW480与靶向多肽FITC-GV12的结合能力结果图。具体实施方式以下所述仅为本专利技术的优选实施例而已，并不用于限制本专利技术，对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。实施例11.实验材料1.1噬菌体肽库、细胞和宿主菌。噬菌体12肽库、大肠杆菌E.coliER2738、人源性结肠癌SW480细胞、人正常肠上皮HIEC细胞。1.2实验试剂L-15培养基、胰蛋白酶、FITG标记兔抗鼠、胎牛血清、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、四环素贮存液、吐温-20（tween-20)、牛血清蛋白BSA、M13噬菌体单链DNA提取试剂盒、IPTG、X-gal、PEG-8000、TMB。1.3实验工作液1×PBS、LB液体培养基、LB-Tet固体平板、顶层琼脂、IPTG/X-gal工作液、IPTG/X-gal平板、PEG-NaCl、TBS缓冲液、0.1%TBST、0.5%TBST、4%多聚甲醛固定液、TBS-NaN3液的配制、3%BSA封闭液、碘化钠缓冲液、TE缓冲液、TMB工作液、四环素贮存液。2.实验方法2.1大肠杆菌的培养。（1）大肠杆菌的复苏：从-80ºC冰箱中取出大肠杆菌甘油冻存液，用接种环取少量划线于LB/Tet固体平板上，然后将此LB/Tet固体平板倒置于37ºC的电热恒温培养箱中培养过夜，使用时挑取单菌落即可。（2）大肠杆菌的培养：在15ml离心管中加入10mlLB/Tet液体培养基，挑取大肠杆菌单菌落加入其中。然后将离心管置于恒温振荡器中培养过夜，待菌液的OD600值为0.5时即可进行相关实验。2.2噬菌体展示肽库的减数筛选。（1）准备细胞：先将6孔培养板经poly-lysine预处理,取人源性结肠癌SW480细胞和人正常肠上皮HIEC细胞,分别用胰蛋白酶处理后铺于其中,培养至细胞成功贴壁且生长状态良好后进行筛选。（2）制备菌液：筛选当天,将大肠杆菌ER2738接种于20mlLB/Tet液体培养基中，置于37ºC恒温振荡器中震荡培养,待菌液的OD600值为0.5时，用于扩增筛选洗脱的噬菌体。（3）无血清培养：吸掉细胞培养基，用PBS洗涤1次后加入无血清培养基，置于通有5%CO2的37ºC恒温细胞培养箱中1h。（4）洗涤:吸掉封闭液,用0.1%TBST较轻地洗涤5次,每次均需旋转以使微孔的底部及边缘都被洗涤,甩干。至第2、3轮筛选时分别用0.5%TBST、1.0%TBST。（5）封本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽，其特征在于，该多肽为以下任意：（1）多肽的氨基酸序列为： YPEIWPTDHKLM（SEQ ID No.1）；（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽，其特征在于，该多肽为以下任意：（1）多肽的氨基酸序列为：YPEIWPTDHKLM（SEQIDNo.1）；（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。2.根据权利要求1所述的一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽，其特征在于，该多肽对肿瘤细胞有靶向结合，与肿瘤细胞特异性结合。3.根据权利要求2所述的一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽，其特征在于，所述的肿瘤细胞为结肠癌细胞。4.如权利要求1所述的一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵琳，魏敏杰，于丽凤，贾真，卫倩，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21