一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法。本发明专利技术提供用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法可以从普通常规材料出发，快速构建目标性状分离的定位群体，且本发明专利技术提供的方法不需要使用非常规材料(如DH系)，在BC1F1代即可对基因进行精细定位与图位克隆，具有简单、快速、高效的优点，可广泛用于对控制同一性状的双隐性基因进行精细定位与图位克隆。

【技术实现步骤摘要】
一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法。
技术介绍
控制同一性状的双隐性基因多由基因组加倍或基因复制产生，在异源四倍体植物中最为常见，如普通烟草、甘蓝型油菜、硬粒小麦等，偶见于二倍体植物，如水稻、玉米等。这类基因由于完全冗余的生物学功能，单个基因的突变不能导致相应的隐性表型。分子标记是当前基因定位最主要和最可靠的手段，在利用分子标记定位控制同一性状的双隐性基因方面，根据所使用的分离群体，目前主要有两种方法：一种是利用F2或BC1F1分离群体，把2个基因作为数量性状位点(Quantitativetraitloci，QTLs)进行定位。该方法由于获得分离群体较快，故可快速获得定位结果，但定位精度较低，通常不用于基因的精细定位与图位克隆。利用这种方法定位的基因有2个水稻育性恢复基因Rf3、Rf(u)和2个硬粒小麦黄绿叶基因ygld1、ygld2等(Lietal.2013；Yaoetal.1997)。另一种是利用多代回交的方法，先将2个显性等位基因通过回交分离到不同的单株之中，然后通过与隐性纯合突变体杂交配制单个基因分离的群体，再分别对其定位。该方法精度较高，常用于基因的精细定位与图位克隆；但由于通常在回交高代进行定位，故花费时间较长。利用这种方法定位的基因有1个甘蓝型油菜雄性不育基因ms2和1个印度芥菜的三室长角果基因mc1等(Leietal.2007；Xuetal.2013)。基于当前现状，开发一种结合上述两种方法优点(简单、快速、高效)的新的基因定位方法，无疑会大大加快双隐性基因精细定位和图位克隆的进程，从而有利于重要多倍体作物的功能基因组学研究和分子标记辅助育种。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何快速定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法。本专利技术提供的用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法包括如下步骤：(1)将突变体植株与野生型植株杂交，得到F1代植株，将所述F1代植株与所述突变体植株杂交，得到BC1F1分离群体；所述突变体植株具有表型A，所述野生型植株具有表型B，所述表型A和所述表型B为同一性状且表型相反；(2)用分子标记对控制同一性状的双隐性基因分别进行初定位，分别获取其在基因组中的初步位置；(3)选取其中一个基因位点，根据其初步位置开发分子标记并基于所述BC1F1分离群体中与所述突变体植株具有相同表型的突变型单株进行精细定位，得到其精细定位区间；(4)在所述精细定位区间内，比对所述野生型植株与所述突变体植株的序列差异，获得候选基因A；(5)通过对所述野生型植株与所述突变体植株的基因组序列进行比对分析，获得所述候选基因A的同源基因，即候选基因B；所述候选基因A和所述候选基因B即为控制同一性状的双隐性基因。上述方法中，所述(1)中，为了增加双亲间的多态性，便于更高效地开发用于基因精细定位的分子标记，可用与所述突变体植株具有相同表型和基因型的植物品种代替所述突变体植株。在本专利技术的具体实施例中，用白肋烟品种TN90代替白茎突变体植株ws1。上述方法中，所述(2)中，所述初定位的方法为现有技术中的常规方法，可采用现有技术中公开的分子标记，具体可参见文献“Mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(NicotianatabacumL.)”中的方法。上述方法中，所述(2)和(3)中，所述分子标记可为SNP标记或SSR标记。在实际应用中，鉴于SSR标记具有使用成本低和检测效率高的特点，优先使用该类标记进行基因定位，如果在精细定位的区间内无法开发SSR标记，则考虑使用SNP标记，SNP标记由于在基因组内分布更广泛，较易开发，但使用成本高，不适合对超大群体进行筛选(精细定位)。在本专利技术的具体实施例中，所述分子标记具体为SSR标记。上述方法中，所述(3)中，所述精细定位的方法包括如下步骤：(3-1)根据所述基因位点的初步位置搜索可以设计SSR引物的简单重复序列，根据所述简单重复序列及其上下游序列设计SSR引物；(3-2)用所述SSR引物检测所述突变体植株和所述野生型植株，选取具有多态性的SSR引物；(3-3)用所述具有多态性的SSR引物检测突变型单株小群体，将所述基因位点定位在区间A内；所述突变型单株小群体为突变型单株群体中的一小部分；所述突变型单株群体为所述BC1F1分离群体中与所述突变体植株具有相同表型的植株组成的群体；(3-4)在所述区间A内搜索可以设计SSR引物的简单重复序列，并根据所述简单重复序列及其上下游序列设计SSR引物，用所述SSR引物检测剩余突变型单株群体，将所述基因位点定位在区间B内，即为所述精细定位区间；所述剩余突变型单株群体为所述突变型单株群体中除了突变型单株小群体以外的剩余植株组成的群体。上述方法中，所述(3-1)和所述(3-4)中，利用SSRHunter软件搜索可以设计SSR引物的简单重复序列。上述方法中，所述(3-1)和所述(3-4)中，根据所述简单重复序列及其上下游150bp序列设计SSR引物。上述方法中，所述(3-2)中，选取具有多态性的SSR引物的方法为选取在所述突变体植株和所述野生型植株中扩增带型不同的SSR引物。上述方法中，所述(3-3)中，用所述具有多态性的SSR引物检测突变型单株小群体，将所述基因位点定位在区间A内的方法为现有技术中的常规方法，具体可参见文献“Mappingoftwowhitestemgenesintetraploidcommontobacco(NicotianatabacumL.)”中的方法。上述方法中，所述植物可为烟草。上述方法中，所述突变体植株为白茎突变体植株ws1或白肋烟品种TN90；所述野生型植株为红花大金元。上述方法中，所述候选基因A为ws1b基因；所述候选基因B为ws1a基因。所述ws1b基因的核苷酸序列为序列表中序列1；所述ws1a基因为序列表中序列2。本专利技术提供了一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的新方法，本专利技术的方法可以从普通常规材料出发，快速构建目标性状分离的定位群体，和Edwardsetal.中的方法相比，主要优点为不需要使用非常规材料(如DH系)，在BC1F1代即可对基因进行精细定位与图位克隆，具有简单、快速、高效的优点，可广泛用于对控制同一性状的双隐性基因进行精细定位与图位克隆。附图说明图1为ws1a和ws1b的初定位与精细定位比较。图2为红花大金元(HD)和TN90(TN)苗期和成株期的表型。图3为标记S5和S7在部分BC1F1隐性单株(白茎)中的扩增情况(*示重组单株)。图4为ws1a和ws1b的精细定位与图位克隆。图5为WS1A和WS1B遗传互补植株与对照的表型比较图。图6为红花大金元(HD)和TN90(TN)叶绿体透射电镜观察。图7为WS1A、ws1a、WS1B和ws1b特异引物在22个白肋烟品种和24个绿茎烟草品种中的扩增情况。图8为WS1A、ws1a、WS1B和ws1b特异引物在部分BC1F1单株中的扩增情况及绿茎单株的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法，包括如下步骤：(1)将突变体植株与野生型植株杂交，得到F1代植株，将所述F1代植株与所述突变体植株杂交，得到BC1F1分离群体；所述突变体植株具有表型A，所述野生型植株具有表型B，所述表型A和所述表型B为同一性状且表型相反；(2)用分子标记对控制同一性状的双隐性基因分别进行初定位，分别获取其在基因组中的初步位置；(3)选取其中一个基因位点，根据其初步位置开发分子标记并基于所述BC1F1分离群体中与所述突变体植株具有相同表型的突变型单株进行精细定位，得到其精细定位区间；(4)在所述精细定位区间内，比对所述野生型植株与所述突变体植株的序列差异，获得候选基因A；(5)通过对所述野生型植株与所述突变体植株的基因组序列进行比对分析，获得所述候选基因A的同源基因，即候选基因B；所述候选基因A和所述候选基因B即为控制同一性状的双隐性基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于定位和克隆植物中控制同一性状的双隐性基因的方法，包括如下步骤：(1)将突变体植株与野生型植株杂交，得到F1代植株，将所述F1代植株与所述突变体植株杂交，得到BC1F1分离群体；所述突变体植株具有表型A，所述野生型植株具有表型B，所述表型A和所述表型B为同一性状且表型相反；(2)用分子标记对控制同一性状的双隐性基因分别进行初定位，分别获取其在基因组中的初步位置；(3)选取其中一个基因位点，根据其初步位置开发分子标记并基于所述BC1F1分离群体中与所述突变体植株具有相同表型的突变型单株进行精细定位，得到其精细定位区间；(4)在所述精细定位区间内，比对所述野生型植株与所述突变体植株的序列差异，获得候选基因A；(5)通过对所述野生型植株与所述突变体植株的基因组序列进行比对分析，获得所述候选基因A的同源基因，即候选基因B；所述候选基因A和所述候选基因B即为控制同一性状的双隐性基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分子标记可为SNP标记或SSR标记。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述(3)中，所述精细定位的方法包括如下步骤：(3-1)根据所述基因位点的初步位置搜索可以设计SSR引物的简单重复序列，根据所述简单重复序列及其上下游序列设计SSR引物；(3-2)用所述SSR...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴新儒，龚达平，刘贯山，王大伟，陈梦，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37