联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种联合Aβ和D‑gal构建的AD模型鼠海马区差异基因表达图谱的构建方法，包括：1)用Aβ和D‑gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；2)用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆损伤，以确定AD模型鼠的成功构建；3)获取AD模型组与正常对照组的海马区样本，对各所述测试海马区基因表达分别获取基因芯片数据；4)各基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，获取差异表达基因，筛选AD模型鼠差异表达的基因谱；5)对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析，以揭示与AD发生的相关分子基础。本发明专利技术将Aβ和D‑gal作为整体AD模型来研究其基因表达谱，有效避免了由外源基因诱导的其他改变表达的错误。

【技术实现步骤摘要】
联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，具体涉及联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用。
技术介绍
阿尔茨海默病(AD)是以认知能力下降和记忆力缺陷为特征的最为普遍的与年龄相关进行性神经退行性疾病，约占所有老年认知功能障碍患者的2/3。虽然AD对患者的行为造成破坏性影响并最终对其生命构成严重威胁，但基于大脑皮质中存在细胞内神经原纤维缠结(NFT)以及在海马区细胞外淀粉样斑块(APs)的临床病理学诊断仅适用于AD中度和终末阶段。目前，AD病例在初期很少被诊断出来。最近，利用代谢组学、蛋白质组学和基因组学技术监测整个AD发展过程中的分子扰动，以筛选诊断治疗靶标的生物标志物。据报道，长期给予D-半乳糖(D-gal)可以诱发行为和神经化学变化，这些变化被应用于模拟脑老化自然过程。同时，β淀粉样蛋白(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)的关键病理标志，并且在该疾病的进展过程中起关键作用。因此，D-gal和Aβ被广泛用于诱导AD、AD样模型研究、AD的作用机制和筛选抗AD药物。先前的研究表明，D-gal和Aβ联合诱导大鼠可更接近AD患者的行为与神经化学变化。基因芯片是同时测量数千个mRNA表达的方便且强大的工具。已有研究报道利用基因芯片分析的方法，探索和识别与疾病或异常疾病相关的新型分子靶点。“逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠海马mRNA表达的影响，李高申等，中国老年学杂志2015年8月第35卷，4199-4201”公开了一种用AD模型鼠探讨逍遥散对阿尔茨海默病的海马mRNA表达的影响，涉及D-gal腹腔注射和Aβ1-42双侧海马注射联合造模，实验鼠经给药处理后剥离其海马，提取RNA并进行反转录，运用实时定量PCR的方法检测mRNA表达变化，该方法构建的大鼠模型与阿尔茨海默病的行为变化相似，但实时定量PCR在检测mRNA表达差异时费时费力，样本量小，不利于挖掘基因差异表达谱。“应用基因芯片筛选β淀粉样蛋白诱导的阿尔茨海默病细胞模型差异表达基因，郭秋野，第一军医大学，2006”公开了一种利用基因芯片研究阿尔茨海默病相关基因表达差异的方法，涉及用Aβ25-35诱导构建AD细胞模型，运用基因芯片筛选该模型与未经诱导的对照细胞间的差异表达基因，分析差异基因的功能，实现高通量检测。但所用模型为细胞模型，体外实验不能精准代表体内变化，且单一使用Aβ25-35诱导效果不稳定。因此，建立一种高度模拟阿尔茨海默病行为变化的实验模型，并对尽可能多的基因进行差异表达分析，得到差异表达分析谱，在生物
具有重要意义和广阔运用前景。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用，将Aβ和D-gal作为整体AD模型来研究其基因表达谱，有效避免了由外源基因诱导的其他改变表达的错误。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，所述方法包括以下步骤：依次用Aβ和D-gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆相关行为，以确定模型鼠的成功建立；用基因芯片获取基因表达数据，并与正常组对照，筛选AD模型鼠差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；最后，对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。根据现有技术，长期给予D-半乳糖(D-gal)可以诱发行为和神经化学变化，这些变化被应用于模拟脑老化自然过程的许多特征。同时，β淀粉样蛋白(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)的关键病理标志，并且在该疾病的进展过程中起关键作用。因此，D-gal和Aβ被广泛用于诱导AD或AD样模型研究AD的作用机制和筛选抗AD药物。先前的研究表明，D-gal和Aβ能联合诱导大鼠更为深刻的类AD行为缺陷。本专利技术提供的测定方法仅建立在化学物质(Aβ和D-gal)的处理，而非引入外源基因(如APP和APP/PS-1)，而建立起来的AD模型鼠，从而有效避免了由外源基因诱导的其他改变表达的错误。优选地，所述方法包括以下步骤：(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内(i.c.v.)注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35(优选为Sigma，USA)，根据StereotaxicAtlas确定注射部位(AP-3.0mm，ML2.0mm，DV2.9mm)；两周后，每天在大鼠皮下注射D-半乳糖，持续50天，以加速AD模型鼠的脑部老化程度；建立AD模型鼠；(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，在Morris水迷宫中测量AD模型鼠的记忆相关行为，验证AD模型鼠的学习记忆损伤；(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，然后利用基因芯片获取AD模型鼠及正常组双侧海马组织的基因表达数据，两组数据对照，筛选出差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，研究AD的分子基础以及AD病理机制。优选地，步骤(1)中，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的浓度为1-10μg/μl，例如可以是1μg/μl、1.5μg/μl、2μg/μl、2.5μg/μl、3μg/μl、3.5μg/μl、4μg/μl、4.5μg/μl、5μg/μl、5.5μg/μl、6μg/μl、6.5μg/μl、7μg/μl、7.5μg/μl、8μg/μl、8.5μg/μl、9μg/μl、9.5μg/μl或10μg/μl以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为2-8μg/μl；优选地，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的用量为2-10μl，例如可以是2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl、5μl、5.5μl、6μl、6.5μl、7μl、7.5μl、8μl、8.5μl、9μl、9.5μl或10μl以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为4-6μl；优选地，在大鼠脑室内注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35后，用青霉素处理3-5天，以预防感染，例如可以是3天、3.2天、3.4天、3.6天、3.8天、4天、4.2天、4.4天、4.6天、4.8天或5天，以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述；优选地，青霉素的用量为1-8×104U/天，例如可以是1×104U/天、1.5×104U/天、2×104U/天、2.5×104U/天、3×104U/天、3.5×104U/天、4×104U/天、4.5×104U/天、5×104U/天、5.5×104U/天、6×104U/天、6.5×104U/天、7×104U/天、7.5×104U/天或8×104U/天以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为2-6×104U/天；优选地，D-半乳糖的浓度为100-200mg/kg，例如可以是100mg/kg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种联合Aβ和D‑gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：依次用Aβ和D‑gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆相关行为，以确定AD模型鼠的成功建立；用基因芯片获取基因表达数据，并与正常组对照，筛选AD模型鼠差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；最后，对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析。

【技术特征摘要】
1.一种联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：依次用Aβ和D-gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆相关行为，以确定AD模型鼠的成功建立；用基因芯片获取基因表达数据，并与正常组对照，筛选AD模型鼠差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；最后，对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析。2.根据权利要求1所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；两周后，每天在大鼠皮下注射D-半乳糖，持续50天；建立AD模型鼠；(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，在Morris水迷宫中测量AD模型鼠的记忆相关行为，验证AD模型鼠的学习记忆损伤；(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，利用基因芯片获取AD模型鼠及正常组双侧海马组织的基因表达数据，两组数据对照，筛选出差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，研究AD的分子基础以及AD病理机制。3.根据权利要求2所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的浓度为1-10μg/μl，优选为2-8μg/μl；优选地，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的用量为2-10μl，优选为4-6μl；优选地，在大鼠脑室内注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35后，用青霉素处理3-5天；优选地，青霉素的用量为1-8×104U/天，优选为2-6×104U/天；优选地，D-半乳糖的浓度为100-200mg/kg，优选为130-180mg/kg；优选地，D-半乳糖的用量为100-200mg，优选为130-180mg。4.根据权利要求2或3所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，让AD模型鼠寻找安全逃离的平台；如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留10-20s；间隔8-15min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练3-7天，每天3-5次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳50-80s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离。5.根据权利要求2-4中任一项所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述基因芯片为RatGenomeArray2302.0；优选地，步骤(3)的具体步骤为：分别通过AffymetrixHybridizationOven640，FluidicsStation450和GeneChipScanner3000对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行杂交、洗涤和扫描；通过AffymetrixMicroarraySuite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；根据以下公式计算倍数变化：如果SIa≥SIb，或者如果SIa≤SIb；其中，FC为倍数变化值；SIa和SIb是...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞娟，吴正治，秦鉴，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东,44