检测和定量微生物的靶核酸序列制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中微生物的靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括扩增所述微生物的核酸的CpG岛中的所述靶序列，而与所述CpG岛的甲基化状态无关。本发明专利技术通过一种用于检测和/或定量埃‑巴二氏病毒(EBV)的靶核酸序列的存在的方法来体现，所述方法是通过扩增从受试者获得的无细胞DNA(cfDNA)中EBV的BamHI‑W区域中的靶序列来实现的。本发明专利技术还提供了一种用于本发明专利技术的方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测和定量微生物的靶核酸序列对相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月18日提交的新加坡临时申请号10201510448Q的优先权益，该新加坡临时申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
本专利技术涉及分子生物学，特别是生物标志物。具体来说，本专利技术涉及检测和定量与诸如细菌、病毒、真菌以及寄生物的微生物相关的生物标志物；以及通过检测和定量与微生物相关的生物标志物来确定患者患有或可能患有与微生物相关的疾病的可能性以及预测患有与微生物相关的疾病的患者的治疗结果的方法。
技术介绍
包括病毒、细菌、真菌以及寄生物在内的微生物的感染已经被认为是人类中广泛疾病的风险因素，如癌症、自身免疫性疾病以及心血管疾病，它们与高死亡率有关。早期检测致病性微生物对于预防、检测、诊断以及治疗与微生物感染相关的这些疾病来说是至关重要的。用于检测微生物的常规方法的实例包括基于培养的程序、血清学测试以及显微镜术。这些方法中的每一种与它自身的限制有关。举例来说，依赖于微生物生长的基于培养的程序常常需要数天才能获得结果，并且这样的程序常常由于经验性抗生素治疗的施用而揭示假阴性结果。血清学测试常常面临由于患者体内不存在抗体产生或抗体产生弱所致的高假阴性率或由于存在交叉反应抗体所致的高假阳性率。显微镜术技术可能受到样品染色和固定以及强烈照射的使用的限制，这可能会破坏或扭曲待检测的微生物的细胞特征。近年来，已经引入了分子诊断程序，如基于PCR的技术来检测微生物感染。然而，目前可用的基于PCR的技术在定量测量患者样品中的细菌/病毒载量方面具有一些限制以及有假阳性结果的问题。因此，需要的是一种具有更好的灵敏度和特异性的检测和/或定量微生物的改进的方法。
技术实现思路
在一个方面，提供了一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中微生物的靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括扩增所述微生物的核酸的CpG岛中的靶序列，而不论所述CpG岛的甲基化状态如何。在另一个方面，提供了一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)的靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括扩增EBV的BamHI-W区中的靶序列，其中所述靶序列包含以下序列：AGATCTAAGGCCGGGAGAGGCAGCCCCAAAGCGGGTGCAGTAACAGGTAATCTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGACTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGAGGCGAATGGGCG(SEQIDNO:1)，其中扩增所述靶序列包括使用一对寡核苷酸引物和探针，其中第一寡核苷酸引物包含序列5'-AGATCTAAGGCCGGGAGAGG-3'(SEQIDNO:2)，并且第二寡核苷酸引物包含序列5'-CGCCCATTCGCCTCTAAAGT-3'(SEQIDNO:3)，并且其中所述探针包含序列5'-(6-FAM)CTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTG(TAMRA)-3'(SEQIDNO:4)，并且其中所述方法是定量聚合酶链反应(qPCR)。在又另一个方面，提供了一种在受试者中检测与微生物感染相关的疾病或患与微生物感染相关的疾病的风险的方法，所述方法包括使用本专利技术的方法在从所述受试者获得的样品中检测和/或定量所述微生物的核酸序列的存在，其中在所述样品中所述微生物的核酸序列的存在指示所述受试者患有与微生物感染相关的疾病或有患与微生物感染相关的疾病的风险。在另一个方面，提供了一种检测和治疗与微生物感染相关的疾病的方法，所述方法包括：(i)使用本专利技术的方法在从所述受试者获得的样品中检测和/或定量所述微生物的核酸序列的存在，其中在所述样品中所述微生物的核酸序列的存在指示所述受试者患有与微生物相关的疾病；以及(ii)向所述受试者施用适用于治疗与所述微生物相关的疾病的药物。在又另一个方面，提供了一种预测患者的与微生物感染相关的疾病的治疗结果的方法，所述方法包括：(i)在治疗之前或在治疗步骤之前定量从所述患者收集的样品中所述微生物的核酸序列，并且在治疗之后或在治疗步骤之后定量从所述同一患者收集的样品中所述微生物的核酸序列；(ii)比较在治疗或治疗步骤之前和之后所述样品中所述微生物的核酸序列的量，其中在治疗或治疗步骤之后所述样品中所述微生物的核酸序列的量减少则指示在所述患者中所述与微生物感染相关的疾病的治疗结果是积极的，其中根据本专利技术的方法对所述样品中所述微生物的核酸序列进行定量。在另一个方面，提供了一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中微生物的核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括对扩增所述微生物的核酸的CpG岛中的靶序列具有特异性的一对寡核苷酸引物。附图说明在结合非限制性实施例和附图考虑时，通过参考详细说明将更好地理解本专利技术，其中：图1描绘了具有使用不同循环生物标志物测量的NPC水平的患有鼻咽癌(NPC)的患者的总体存活率曲线。使用卡普兰-迈耶图(Kaplan-Meierplot)显示二分生物标志物变量的结果。图1A示出了具有使用qPCR通过每毫升BamHI-W的拷贝数测量的EBV的NPC患者的总体存活率曲线。图1B示出了具有使用qPCR通过每毫升EBNA1的拷贝数测量的EBV的NPC患者的总体存活率曲线。图1C示出了具有使用dPCR通过每毫升EBNA1的拷贝数测量的EBV的NPC患者的总体存活率曲线。图1D和图1E示出了具有根据循环肿瘤细胞(CTC)的计数测量的NPC水平的NPC患者的总体存活率曲线。结果显示BamHI-W水平(使用dPCR检测)和EBNA1水平(使用dPCR或qPCR检测)与CTC相比是用作总体存活率的更好的指标。图2是描绘了使用不同EBV生物标志物检测NPC的总体结果的流程图。总共46个NPC患者(全部都是亚洲种族)参与所述研究。已经对从这些患者中的每一个收集的血液样品进行了所有三种测定，即BamHI-WqPCR测定、EBNA1qPCR测定、以及EBNA1dPCR测定。如流程图中所示，BamHI-WqPCR测定检测到41个患者呈NPC阳性并且5个患者呈NPC阴性；EBNA1qPCR测定检测到31个患者呈NPC阳性并且15个患者呈NPC阴性；EBNA1dPCR测定检测到39个患者呈NPC阳性并且7个患者呈NPC阴性。所述结果表明与EBNA1qPCR测定和EBNA1dPCR测定相比，BamHI-WqPCR测定对于检测NPC具有更好的灵敏度。图3是描绘了设计和选择合成内部对照的过程的流程图。使用R程序产生具有150个碱基的长度的50个随机序列。消除了具有多碱基重复和循环(即ATATAT、CCCCCC等)的序列。15个序列通过了该标准。针对这15个序列设计引物和探针以使得靶序列具有约100bp并且位于具有150个碱基的序列的中心区域。通过NetPrimer程序检查引物二聚体和引物-探针二聚体形成。所有引物和探针之间的ΔG值(在内部对照(IC)和BamHI-W反应中)必须比-9千卡/摩尔更正(参见表1)。只有一个序列符合该标准，然后使用BLAST程序在NCBI基因组参考序列(NCBIGenomicReferenceSequences)、NCBI染色体序列(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中微生物的靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括扩增所述微生物的核酸的CpG岛中的靶序列，而不论所述CpG岛的甲基化状态如何。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.18 SG 10201510448Q1.一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中微生物的靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括扩增所述微生物的核酸的CpG岛中的靶序列，而不论所述CpG岛的甲基化状态如何。2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶序列处于所述微生物的核酸的CpG岛的核酸的5'末端内。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法是聚合酶链反应(PCR)。4.如权利要求3所述的方法，其中所述聚合酶链反应选自由以下各项组成的组：定量聚合酶链反应、数字聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、以及传统聚合酶链反应。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中从所述受试者获得的所述样品是血浆样品、血清样品或全血样品。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中从所述受试者获得的所述样品包含cfDNA(无细胞DNA)。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微生物是病毒、细菌、真菌或寄生物。8.如权利要求7所述的方法，其中所述微生物是病毒。9.如权利要求7所述的方法，其中所述微生物是细菌。10.如权利要求8所述的方法，其中所述病毒是埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrrvirus)(EBV)。11.如权利要求10所述的方法，其中所述靶序列处于EBV的BamHI-W区域的CpG岛中。12.如权利要求11所述的方法，其中EBV的BamHI-W区域的所述CpG岛选自由以下各项组成的组：CTCCTCTCCAACCTTCGCTCCACCCTAGACCCCAGCTTCTGGCCTCCCCGGGTCCACCAGGCCAGCCGGAGGGACCCCGGCAGCCCGGGCGAGTCGCCTTCCCTCTCCCCTGGCCTCTCCTTCCCGCCTCCCACCCGAGCCCCCTCAGCTTGCCTCCCCACCGGGTCCATCAGGCCGGCCGGAGGGACCCCGGCGGCCCGGTGTCA(SEQIDNO.:6)；AGGCCATGCGCGCCCTGTCACCAGGCCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAGGCCGGGAGAGGCAGCCCCAAAGCGGGTGCAGTAACAGGTAATCTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGACTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGAGGCGAATGGGCGCCATTTTGTCCCCACGCGCGCATAATGGCGGACCTAGGCCTAAAACCCCCAGGAAGCGGGTCTATGGTTGGCTGCGCTGCTGCTATCTTTAGAGGGGAAAAGAGGAATAAGCCCCCAGACAGGGGAGTGGGCTTGTTTGTGACTTCACCAAAGGTCAGGGCCCAAGGGGGTTCGCGTTGCTAGGCCACCTTCTCAGTCCAGCGCGTTTACGTAAGC(SEQIDNO.:7)；CTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATTTCTGGTCGCATCAGAGCGCCAGGAGTCCACACAAATGTAAGAGGGGGTCTTCTACCTCTCCCTAGCCCTCCGCCCCCTCCAAGGACTCGGGCCCAGTTTCTAACTTTTCCCCTTCCCTCCCTCGTCTTGCCCTGCGCCCGGGGCCACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATCCAAGCCTAGGGGAGACCGAAGTGAAGGCCCTGGACCAACCCGGCCCGGGCCCCCCGGTATCGGGCCAGAGGTAAGTGGACTTTAATTTTTTCTGCTAAGCCCAACACTCCACCACACCCAGGCACACACTACACACACCCACCCGTCTCAGGGTCCCCTCGGA(SEQIDNO.:8)；以及CGAGGAGGCGCCCGGAGTGGGGCCGGTCGGCTGGGCTGGCCGAGCCCGGGTCTGGGAGGTCTGGGGTGGCGAGCCTGCTGTCTCAGGAGGGGCCTGGCTCCGCCGGGTGGCCCTGGGGTAAGTCTGGGAGGCAGAGGGTCGGCCTAGGCCCGGGGAAGTGGAGGGGGATCGCCCGGGTCTCTGTTGGCAGAGTCCGGGCGATCCTCTGAGACCCTCCGGGCCCGGACGGTCGCCCTCAGCCCCCCAGACAGACCCCAGGGTCTCCAGGCAGGGTCCGGCATCTTCAGGGGCAGCAGGCTCACCACCACAGGCCCCCCAGACCCGGGTCTCGGCCAGCCGAGCCGACCGGCCCCGCGCCTGGCGCCTCCTCGGGGCCAGCCGCCGGGGTTGGTTCTGCCCCTCTCTCTGTCCTTCAGAGGAACCAGGGACCTCGGGCACCCCAGAGCCCCTCGGGCCCGCCTCCAGGCGCCCTCCTGGTCTCCGCTCCCCTCTGAGCCCCGTTAAACCCAAAGAATGTCTGAGGGGAGCCACCCTCGG(SEQIDNO.:9)。13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述靶序列包含选自由以下各项组成的组的序列：AGATCTAAGGCCGGGAGAGGCAGCCCCAAAGCGGGTGCAGTAACAGGTAATCTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGACTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGAGGCGAATGGGCG(SEQIDNO.:1)；GGAATAAGCCCCCAGACAGGGGAGTGGGCTTGTTTGTGACTTCACCAAAGGTCAGGGCCCAAGGGGGTTCGCGTTGCTAGGCCACCTTCTCAGTCCAGCGCGTTTACGTAA(SEQIDNO.:10)；AGGAAGCGGGTCTATGGTTGGCTGCGCTGCTGCTATCTTTAGAGGGGAAAAGAGGAATAAGCCCCCAGACAGGGGAGTGGGCTTGTTTGTGACTTCACCAAAGGTCAGGGCCCAAGGGGGTTCGCGTTGCTAGGCCACCTTCTCAGTC(SEQIDNO.:11)；其互补序列、片段以及变体。14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中扩增所述靶序列包括使用一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含选自由以下各项组成的组的序列：5'-AGATCTAAGGCCGGGAGAGG-3'(SEQIDNO.:2)，5'-GGAATAAGCCCCCAGACAGG-3'(SEQIDNO.:12)，5'-AGGAAGCGGGTCTATGGTTG-3'(SEQIDNO.:13)，其片段以及变体，并且第二寡核苷酸引物包含选自由以下各项组成的组的序列：5'-CGCCCATTCGCCTCTAAAGT-3'(SEQIDNO.:3)，5'-TTACGTAAACGCGCTGGACT-3'(SEQIDNO.:14)，5'-GACTGAGAAGGTGGCCTAGC-3'(SEQIDNO.:15)，其片段以及变体。15.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中扩增所述靶序列进一步包括使用能够与所述靶序列结合的探针。16.如权利要求15所述的方法，其中所述探针包含选自由以下各项组成的组的序列：5'-CTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTG-3'(SEQIDNO.:16)，5'-CCACCTTCTCAGTCCAGCGCGTTT-3'(SEQIDNO.:17)，5'-GTGACTTCACCAAAGGTCAGGGCCC-3'(SEQIDNO.:18)，5'-GGTGGTAAGCGGTTCACCTTCAGGG-3'(SEQIDNO.:19)，其片段以及变体。17.如权利要求10至16中任一项所述的方法，所述方法进一步包括计算扩增产物中BamHI-W区域的拷贝数，其中所述拷贝数是使用下式计算的：18.如权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述方法能够检测的EBV的最低浓度为每毫升样品100IU(国际单位)，或每毫升样品10IU或每毫升样品1IU。19.一种用于检测和/或定量从受试者获得的样品中埃-巴二氏病毒(EBV)的靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈民汉，吴舒红英，
申请(专利权)人：路胜基因新加坡私人有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG