提供使用机械拉伸或瞬时受体电位阳离子通道‑香草酸亚家族成员4(Trpv4)激动剂制备如自体和/或异基因HSC等造血干细胞(HSC)群体的方法，和HSC在移植中的使用的方法。具体而言，所述方法包括提供包含生血内皮(HE)细胞的群体细胞，使HE细胞与一定量的Trpv4的激动剂接触；和/或使细胞经历周期性2维拉伸，持续一段时间并且在足以刺激内皮‑向‑HSC的转变的条件下进行。还公开了治疗恶性或非恶性血液、代谢或免疫失调的方法，其包括向受试者给予治疗有效量的通过所述方法得到的HSC。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生成功能性造血干细胞的方法优先权声明本申请要求2015年12月3日提交的美国临时申请系列号62/262,464和2016年5月6日提交的美国临时申请系列号62/332,853的权益。将前述的全部内容引入于此以作参考。联邦政府资助的研究或开发本专利技术是在国立卫生研究院授予的基金号5K01DK085217、2R03DK100672和5R01HL131645下由政府支持完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
本文记载了使用机械拉伸或Trpv4激动剂来制备如自体和/或异基因HSC等造血干细胞(HSC)群体的方法，和HSC在移植中的使用的方法。
技术介绍
HSC移植(HSCT)广泛用于治疗具有血液、骨髓、代谢和免疫疾病的患者(1-5)。尽管脐带和单倍同一性干细胞移植改进，HSC移植的治疗用途经常由于难以及时发现合适的人白细胞抗原(HLA)匹配的供体而受到限制，特别是在少数民族和缺乏国家无关的供体登记的国家(6-9)。尽管混血人群占美国人口的1.6％(970万)，但混血志愿者仅占登记册中7百万人的3％(21,000)，还有6,000名患者没有骨髓匹配。即使有人发现了合适的匹配，免疫并发症如移植物抗宿主病(GVHD)、供体排斥、和高的治疗相关死亡率也可能影响患者的生存。然而，这些并发症被自体移植所消除。尽管自体HSC不会完全替代异基因HSC，特别是在恶性血液病的背景下，但是他们将克服HSCT中的主要障碍，包括对于具有广泛跨度的恶性和非恶性血液、免疫和代谢失调的患者而言缺乏供体可用性和GVHD等障碍(3-5,15)。
技术实现思路
本文记述了开发人生血内皮细胞源的、临床级别的HSC用于治疗恶性和非恶性血液、代谢和免疫失调的方法。因此，本文记述了用于制备造血干细胞(HSC)群体的方法。所述方法包括提供包括生血内皮(HE)细胞的群体，和(i)使HE细胞与一定量的瞬时受体电位阳离子通道-香草酸亚家族成员4(Trpv4)的激动剂接触；和/或(ii)使所述细胞经历周期性2维拉伸，持续一段时间并在足以刺激内皮-向-HSC的转变的条件下进行。在一些实施方案中，所述受试者不具有恶性血液病。本文还提供治疗具有血液、骨髓、代谢和免疫疾病的受试者的方法；所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的造血干细胞(HSC)，所述造血干细胞通过本文记述的方法、例如包括以下的方法获得：提供包括生血内皮(HE)细胞的群体，和(i)使HE细胞与一定量的瞬时受体电位阳离子通道-香草酸亚家族成员4(transientreceptorpotentialcationchannel-subfamilyvanilloidmember4,Trpv4)的激动剂接触；和/或(ii)使所述细胞经历周期性2维拉伸，持续一段时间并在足以刺激内皮-向-HSC的转变的条件下进行。在一些实施方案中，用于本文记述的方法的HE细胞从诱导多能干细胞(iPSC)获得，例如使用既定方法首先将皮肤或CD34+细胞转变成诱导多能干细胞(优选人iPSC)。然后使用本领域公知的和/或本文记述的方法将此类人iPSC分化成人HE细胞。例如，人iPSC向EB的分化可以在药物、生长因子、细胞因子混合剂(cocktails)的存在下发生从而诱导生血内皮命运，接着在7-9天之间分选细胞并进一步用已确定的混合剂温育来富集HE细胞。在一些实施方案中，Trpv4的激动剂选自由以下组成的组：花生四烯酸、5,6-EET、8,9-EET，双穿心莲内酯A(BAA)，佛波酯(如4α-PDD和4α-PDH)，RN-1747，取代的1,4-二氨基丁烷或1,3-二氨基丙烷类似物；和GSK10116790A。在一些实施方案中，HE细胞或IPSC从具有血液、骨髓、代谢或免疫疾病的受试者获得。在一些实施方案中，Trpv4的激动剂选自由以下组成的组：花生四烯酸、5,6-EET、8,9-EET，双穿心莲内酯A(BAA)，佛波酯(如4α-PDD和4α-PDH)，RN-1747，取代的1,4-二氨基丁烷或1,3-二氨基丙烷类似物；和GSK10116790A。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，如人。在一些实施方案中，受试者具有多发性骨髓瘤；非何杰金淋巴瘤；何杰金病；急性髓性白血病；神经母细胞瘤；生殖细胞瘤；自身免疫性失调(系统性红斑狼疮(SLE)或系统性硬化病)；或淀粉样变性。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本专利技术的方法和材料；也可以使用本领域公知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的且不意欲限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献都以其全部内容引入以作参考。在冲突的情况下，本说明书包括定义将作出控制。从以下详细的说明和附图、以及从权利要求中，本专利技术的其他特征和优点将显而易见。附图说明图1A-G.尽管剪切应力通路的抑制和早期循环停滞但造血干细胞出现。(A-B)30-42hpf之间对照和cdh5沉默的胚胎中从flk1:mCherry+内皮细胞出现的cd41:eGFP+HSC的延时共焦成像，表明cdh5的缺失和因而受损的循环，并没有影响cd41:eGFP+HSC的内皮出现(实施例用箭头标记)。(C)zf-runx1和zf-c-Myb表达水平的qRT-PCR分析，证实了尽管cdh5-吗啡啉突变体(morphant)胚胎中cdh5缺失和NOS通路抑制，但HSC替代标志物的表达水平正常。(D-E)野生型(对照)flk1:mCherry和malbec::flk1:mCherry的共焦成像证实动脉和静脉在缺乏cdh5下形成。(F-G)21-48hpf之间的lcr:eGFP+红细胞以及flk1:mCherry+血管结构形成的延时共焦成像。在21hpf时，来自原始造血作用的红细胞存在于AGM区。23hpf时心跳一开始，红细胞就开始在对照胚胎中循环，且在25-48hpf之间内皮标志物的表达明显，这表明血管形成。与之相反，尽管心跳开始且血管形成，但lcr:eGFP+红细胞在cdh5-吗啡啉突变体的AGM区中累积，表明早期循环停滞。图2A-E.cdh5-吗啡啉突变体胚胎具有正常的心率、受损的心输出量和异常的心脏形态学。(A)对照和cdh5-吗啡啉突变体胚胎(0.2-0.4mM)中斑马鱼心脏的心电描记法，表明cdh5-吗啡啉突变体具有正常的心率。(B)对照和cdh5-吗啡啉突变体胚胎(0.2-0.4mM)中的心输出量，表明cdh5-吗啡啉突变体不具有心输出量。(C)cdh5-吗啡啉突变体的微血管造影，表明在心房中捕获cdh5-吗啡啉突变体心脏中注射的荧光染料，如心包水肿所见。(D)从对照和cdh5-吗啡啉突变体分离的心脏使用抗心肌细胞肌球蛋白重链(MF20)和内皮细胞(Flk1)的抗体的免疫组织化学，表明心房、心室和流出道扭曲。*P<0.05图3A-C.血管中的脉动是由心跳造成的。(A)3D多普勒分析来测量野生型和cdh5-吗啡啉突变体胚胎中的脉动速率，表明cdh5-吗啡啉突变体在缺乏血液流动下具有正常的脉动速率。(B-C)对照胚胎中lcr:eGFP::flk1:mCherry的延时共焦成像，接着脉动血管的运动-频率相关值本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备造血干细胞(HSC)群体的方法，所述方法包括：提供包括生血内皮(HE)细胞的群体，和(i)使所述HE细胞与一定量的瞬时受体电位阳离子通道‑香草酸亚家族成员4(Trpv4)的激动剂接触；和/或(ii)使所述细胞经历周期性2维拉伸，持续一段时间并在足以刺激内皮‑向‑HSC的转变的条件下进行。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.03 US 62/262,464;2016.05.06 US 62/332,8531.一种制备造血干细胞(HSC)群体的方法，所述方法包括：提供包括生血内皮(HE)细胞的群体，和(i)使所述HE细胞与一定量的瞬时受体电位阳离子通道-香草酸亚家族成员4(Trpv4)的激动剂接触；和/或(ii)使所述细胞经历周期性2维拉伸，持续一段时间并在足以刺激内皮-向-HSC的转变的条件下进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述HE细胞从iPSC获得。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Trpv4的激动剂选自由以下组成的组：花生四烯酸、5,6-EET、8,9-EET，双穿心莲内酯A(BAA)，佛波酯(如4α-PDD和4α-PDH)，RN-1747，取代的1,4-二氨基丁烷或1,3-二氨基丙烷类似物；和GSK10116790A。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞从具有血液、骨髓、代谢或免疫疾病的受试者获得。5.根据权利要求1所述的方法，其中受试者不具有恶性血液病。6.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·I·莎，G·Q·戴利，
申请(专利权)人：布里格姆妇女医院，
类型：发明
国别省市：美国,US
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