本发明专利技术是公开了一种基于均相酶测定技术，用于测定样品中脑钠肽前体N‑末端肽（N‑terminal pro‑brain natriuretic peptide,NT pro‑BNP）的含量。该试剂包含抗NT pro‑BNP特异性抗体、酶‑NT pro‑BNP复合物，利用酶‑NT pro‑BNP复合物与抗NT pro‑BNP特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‑NT pro‑BNP复合物活性受到抑制，通过测定反应体系中酶活性的变化，从而得到结合的酶标记物数量，从而得到待测样品中NT pro‑BNP的含量。该方法可应用于半自动或全自动生化分析仪，操作简单，检测时间短，灵敏度高，符合临床的需求。
【技术实现步骤摘要】
一种NT-proBNP免疫法测定试剂制备和检测方法
本专利技术涉及到小分子与蛋白质定向连接、抗原抗体反应的检测方法，属于医学生物学领域。是基于均相的免疫学酶法测定。尤其涉及一种检测NTpro-BNP的方法和试剂盒的制备。
技术介绍
脑钠肽前体N-末端肽(N-terminalpro-brainnatriureticpeptide,NTpro-BNP)是一种心脏分泌的神经激素，当心室壁张力增加时,心室肌细胞受到牵拉刺激，就会以激素原的形式爆发式合成，NT-proBNP由脑利纳肽原(pro-brainnatriureticpeptide，pro-BNP1-108)代谢生成的氨基末端1-76个氨基酸组成，如图1所示。1988年日本学者TetsujiSudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为BNP1。目前用于临床检测的BNP包括BNP77-108和NT-proBNP两种。虽然两者有相同的生物学来源，但生物学效应和临床意义不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体(pre-proBNP)，该肽的一个26氨基信号肽被立即去除，形成含108个氨基酸的的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的脑钠肽前体N-末端肽(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、有活性的B型利钠肽(BNP)。BNP的清除主要通过与BNP清除受体结合，而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，因此其血浓度受肾功能影响大于BNP。BNP半衰期短(22分钟)，体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期较长(120分钟),体外稳定性强，在心衰患者中的浓度较BNP高，与BNP相比更有利于心衰的诊断。大量基础和临床研究表明，血液中的BNP水平在心力衰竭时显著升高，作为一种新的生物标记物，对心力衰竭的诊断和预后评估具有重要的价值。因此，最早在ESC慢性心力衰竭指南2(2001年)，继而在美国ACC/AHA慢性心力衰竭指南3(2005年)中推荐将血液BNP水平测定作为心力衰竭的诊断和预后指标。2008年ESC的急性和慢性心力衰竭指南4和2009年AHA心力衰竭指南5对此作了进一步的推荐。因此，NT-proBNP不仅仅用于诊断和筛查(早期)心功能不全，对多种疾病的预后、危险度分层、手术时间选择也有较高的价值，在临床上具有重要的应用价值。目前，定量测定NTpro-BNP的方法，有高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(HPLC-MS)，放射性免疫分析法(RIA)、床旁检测(POCT)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)以及。其中高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(HPLC-MS)需要设备比较昂贵，操作复杂，通量小，不适合大规模应用；放射性免疫分析法(RIA)则容易对操作者造成辐射损伤，也不利于广泛应用；酶联免疫吸附法(ELISA)存在操作复杂，检测时间长，自动化程度低，重复性较差，不利于仪器自动化和标准化；目前的床旁检测POCT速度较快，但是需要特定仪器，并且准确性较低，重复性差，并且其测定的全血样本，参考值没有明确的标准；电化学发光免疫分析法(ECLIA)是现在的主流技术，但是主要是以罗氏为代表的国际厂商所垄断，没有国产厂家，需要配套的仪器和试剂盒，成本较高，难以普及。抗NTpro-BNP抗体的制备难度较高，存在特异性不好和线性范围小的缺点。与pro-BNP存在较大的交叉反应，特异性差，制备的试剂特异性差。有文献报道类似NTpro-BNP这种多肽的半抗原制备方法决定了制备的抗体的特异性和亲和力。多肽同载体蛋白的连接位点决定了制备抗体的特异性，要保证多肽的特异性抗原决定簇不在半抗原偶联过程中被破坏。载体蛋白同半抗原合适的连接臂长度能够保证多肽的充分暴露，如果过长，会大大降低多肽的免疫原性，太短，载体蛋白会影响多肽的结构。本专利技术采用特异性的连接臂，通过连接位点的定向选择，羧基端或者氨基端，充分暴露NTpro-BNP的免疫位点，从而获得高亲和力及高特异性的抗体。目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强、尤其是适合自动化检验的的NT-proBNP检测试剂。本专利技术采用酶偶联NT-proBNP复合物，与NT-proBNP特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶-NTpro-BNP复合物的活性就受到抑制。样品中的NTpro-BNP与酶-NTpro-BNP复合物竞争性结合抗NTpro-BNP特异性抗体。样品中的NTpro-BNP越多，结合的抗体就越多。酶-NTpro-BNP复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中NTpro-BNP的含量。检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，具有较高的应用价值。
技术实现思路
本检测方法基于免疫学反应，采用均相免疫的酶学测定方法，将小分子NTpro-BNP与酶通过蛋白质连接技术形成复合物，与样品中的待测NTpro-BNP与抗NTpro-BNP特异性抗体竞争结合，通过酶活性的高低来实现样品中NTpro-BNP浓度的检测。该方法可以提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中NTpro-BNP含量的均相酶免疫检测试剂及其制备方法。该试剂可应用于临床中广泛使用的各种类型的自动生化分析仪，从而达到大规模样品的测定要求，提高了实用性。本专利技术提供了检测NTpro-BNP的试剂盒，包含试剂R1，试剂R2，缓冲液，稳定剂，NTpro-BNP参考标准品的液体试剂盒。进一步的，一个优选的技术方案是：一种NTpro-BNP均相免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗NTpro-BNP特异性抗体、用于检测抗NTpro-BNP特异性抗体-NTpro-BNP复合物的检测试剂制备及检测方法；上述NTpro-BNP均相免疫检测试剂盒基于以下原理：含有NTpro-BNP的生物样品同NTpro-BNP-G6PDH酶复合物竞争结合抗NTpro-BNP特异性抗体；NTpro-BNP-G6PDH酶复合物与抗NTpro-BNP特异性抗体形成免疫结合物后，其催化底物葡萄糖-6-磷酸的活性降低或丧失，反应产物NADH的量也降低；测定样品中NTpro-BNP的浓度量越高，竞争到的抗NTpro-BNP特异性抗体越多，抗NTpro-BNP特异性抗体对NTpro-BNP-G6PDH酶复合物的活性抑制越低，则反应生成的NADH量越多；根据测定NADH的量计算，从而得到样品中的NTpro-BNP含量。根据这一专利技术目的，进一步的一个优选实施方案：其中制备NTpro-BNP免疫原用于制备抗NTpro-BNP特异性抗体。优选的利用NTpro-BNP多肽的羧基端同载体蛋白交联，优选的连接臂基团为-NH-(CH2)3-S-；载体蛋白优选兔白蛋白；免疫动物优选新西兰大白兔；化学偶联方式优选Ellman试剂法；上述优选方法制备的抗NTpro-BNP特异性抗体对NTpro-BNP亲和力高，特异性好，同proBNP、BNP77-108无交叉反应。根据这一专利技术目的的一个优选实施方案，其中制备NTpro-BNP-酶复合物用于测定NTpro-BNP测定试剂盒。优选的酶为葡萄糖-6-磷酸脱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测定样品中NT pro‑BNP的方法，其特征在于：由试剂R1、试剂R2和NT pro‑BNP参考标准品的组成；所述试剂R1中含有抗NT pro‑BNP特异性抗体、酶反应底物、稳定剂；所述试剂R2含有酶‑NT pro‑BNP复合物、稳定剂。
【技术特征摘要】
1.一种测定样品中NTpro-BNP的方法，其特征在于：由试剂R1、试剂R2和NTpro-BNP参考标准品的组成；所述试剂R1中含有抗NTpro-BNP特异性抗体、酶反应底物、稳定剂；所述试剂R2含有酶-NTpro-BNP复合物、稳定剂。2.根据权利要求1所述的抗NTpro-BNP特异性抗体，由采用Ellman试剂法将NTpro-BNP同兔血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫动物得到。3.根据权利要求1所述的酶-NTpro-BNP复合物的制备，其特征在于，NTpro-BNP加入MES缓冲液中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：周裕军，许秀丽，吴鸣月，
申请(专利权)人：北京丹大生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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