一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法。该方法包括：将待测植物的器官或组织置于交联液中，所述交联液中含有能够与靶标激素交联从而形成半抗原的物质；将处理过的所述待测植物的器官或组织置于渗透液中，增加渗透性；处理过的所述待测植物的器官或组织进行一抗、二抗孵育，然后显色，从而实现在所述待测植物的器官或组织中对所述靶标激素的整体定位检测。本发明专利技术所提供的方法无需制备切片，可以在植物器官和组织中对激素进行整体原位检测。本发明专利技术方法更加快速便捷，对研究植物体内激素的分布和变化，具有特别重要的意义。

A method for locating phytohormones in plant organs or tissues.

The invention discloses a method for overall positioning detection of hormones in plant organs or tissues. The method comprises: placing an organ or tissue of the plant to be tested in a crosslinking solution containing a substance capable of crosslinking with a target hormone to form a hapten; placing the treated organ or tissue of the plant to be tested in a osmotic solution to increase permeability; and entering the treated organ or tissue of the plant to be tested. First and second antibodies are incubated and then colored to achieve the overall localization detection of the target hormones in the organs or tissues of the plant to be tested. The method provided by the invention does not require preparation of slices, and can be used for in situ detection of hormones in plant organs and tissues as a whole. The method of the invention is more rapid and convenient, and has special significance for studying the distribution and change of hormones in plants.

【技术实现步骤摘要】
一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法及应用。
技术介绍
植物激素生长素(Auxin)在植物发育中起着至关重要的作用，是调控植物胚胎发育和胚后发育的关键影响因子，调节包括雌配子体图式形成、胚胎发育、器官发生、分生组织活动，以及对环境刺激和其他的生长反应等许多的过程。生长素作用的一个关键方面是它依赖于局部生长素生物合成和定向、细胞间的生长素运输呈梯度分布(生长素梯度)。这一极性运输在大部分生长素调控的过程中起至关重要的作用，生长素在不同细胞和组织间极性运输，由此产生的生长素峰值和梯度对植物器官发生和形态建成起着决定性作用。不仅如此，生长素在诱导分生细胞产生、维持细胞干性方面也发挥重要作用：在茎端分生组织(SAM)发育过程中，干细胞的维持机制则是由生长素与细胞分裂素的平衡来共同完成的(Moubayidinetal.,2009；Zhaoetal.,2010)，生长素浓度梯度分布模式决定了叶原基的发生位置和叶序的形成(Fleming,2005；Heisleretal.,2005)。在根的发育过程中，生长素能够通过诱导中柱鞘细胞成为奠基细胞从而对侧根的发生位置起决定作用(Dubrovskyetal.,2008)，生长素通过极性运输在根端分生组织(RAM)中积累维持干细胞的活性(TerpstraandHeidstra,2009)。生长素还参与到维管束发育、蔽荫反应、向性反应、生物与非生物胁迫的过程(SantnerandEstelle,2009)。此外，生长素还可以调控细胞的分裂与伸长：已知生长素可以调控细胞周期蛋白CDKA/CYCD复合体的形成从而参与细胞G1/S期的转换；同时生长素还可以调节细胞壁的松弛程度导致细胞膨大，引起细胞的伸长(Perrot-Rechenmann,2010)。所有侧生器官的发生都是生长素浓度梯度和转录因子表达区域相互作用的结果(Benkovaetal.,2003；Fleming,2005)。之所以生长素在植物生长发育中的呈现出如此重要和复杂的作用，除了与生长素需要以形成特定的浓度梯度发挥作用以外，生长素时空特异性的原位合成和稳态调节以及快速而有效地信号响应机制也是保证其精细调控不同发育事件的重要因素。因此生长素在植物组织或器官中的分布是大家关心的热点之一。植物激素作用的组织定位，成为深入研究激素调控机理的瓶颈，其挑战主要来自于激素类小分子物质在植物体内的流动性强，原位固定难。激素影响植物发育已是不争的事实，但激素如何影响及其调控的部位和机理人们并不清楚，主要原因是人们不能有效地确定激素作用的具体部位。要确定激素作用的靶位置，必须对激素进行原位的定量和定位。激素的定量测定在技术上已经比较成功，但激素的定位，特别是整体水平的定位，目前尚无成熟的技术。因此要深入研究激素调控植物发育的机理，建立一套有效的激素原位定位技术，并利用该技术来研究激素的分布和变化，具有特别重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法。本专利技术所提供的在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法，不包括将待测植物的器官或组织制成切片的步骤；所述方法可包括如下步骤：(a)将所述待测植物的器官或组织置于交联液中进行处理，所述交联液中含有能够与靶标激素交联从而形成半抗原的物质；(b)将经步骤(a)处理过的所述待测植物的器官或组织置于渗透液中进行处理，增加渗透性；(c)对经步骤(b)处理过的所述待测植物的器官或组织进行一抗孵育和二抗孵育，所用一抗为抗所述靶标激素的抗体，所用二抗为抗所述一抗的抗体，然后进行显色反应，从而实现在所述待测植物的器官或组织中对所述靶标激素的整体定位检测。在步骤(a)中，所述交联液的组成如下：每100mL所述交联液中含有3g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，余量为PBST。EDC可以交联生长素成为半抗原。其中，所述PBST为在1×PBS溶液中添加0.1％(体积百分含量)吐温-20后所得溶液(注：下文出现的PBST配方与此相同)。所述1×PBS溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.13MNaCl，3mMKCl，7mMNa2HPO4.2H2O，3mMKH2PO4；pH7.2。在步骤(a)中，将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液中进行处理具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液中，抽气直到所述待测植物的器官或组织下沉，2-8℃(如4℃)黑暗中处理40-60分钟。在步骤(a)和步骤(b)之间还可包括对所述待测植物的器官或组织进行固定和/或脱色素处理的步骤。其中，所述固定可为利用4％PFA多聚甲醛固定液(pH7.2PBS配制)对所述待测植物的器官或组织进行固定。所述脱色素处理可为利用甲醇对所述待测植物的器官或组织进行脱色素。进一步地，所述固定具体可按照包括如下步骤的方法进行的：将所述待测植物的器官或组织置于4％PFA多聚甲醛固定液(pH7.2PBS配制)中，抽气直至所述待测植物的器官或组织下沉，然后换新的4％PFA多聚甲醛固定液(pH7.2PBS配制)，4℃固定12-16h；其中，所述4％PFA多聚甲醛固定液的配制方法如下：4克多聚甲醛溶于所述1×PBS溶液(配方见上文)中，65℃下搅拌，加50μL新配的1N的NaOH，冷却后加4mLNP-40和15mLDMSO。进一步地，所述脱色素处理具体可按照包括如下步骤的方法进行：为了防止材料直接进入甲醇引起细胞形态剧烈变化，将所述待测植物的器官或组织依次置于如下溶液中进行梯度置换：(a1)2％PFA多聚甲醛固定液，20min；(a2)PBST，20min；2次；(a3)PBST中添加体积百分含量为25％的甲醇后所得溶液，20min；(a4)PBST中添加体积百分含量为50％的甲醇后所得溶液，20min；(a5)PBST中添加体积百分含量为75％的甲醇后所得溶液，20min；(a6)100％甲醇，室温(20-25℃)，直到所述待测植物的器官或组织由绿色变为无色为止；(a7)甲醇：乙醇依次按体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的比例混合后所得五份溶液，以及纯乙醇进行梯度置换，每级20min。至此步可以将材料放于-20℃长期保存。在(a1)中，所述2％PFA多聚甲醛固定液的配制方法如下：2克多聚甲醛溶于所述1×PBS溶液(配方见上文)中，65℃下搅拌，加50μL新配的1N的NaOH，冷却后加4mLNP-40和15mLDMSO。在步骤(b)中，所述渗透液具体可按照如下进行配置：25mL20×SSC，0.1mL吐温-20，3gSDS，用水定容到100mL；然后在65℃放置至少30分钟。进一步地，所述20×SSC的溶剂为水，溶质及浓度如下：3MNaCl，300mM柠檬酸钠；pH7.0。在步骤(b)中，将所述待测植物的器官或组织置于渗透液中进行处理具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述待测植物的器官或组织置于所述渗透液中，65℃，2小时。此步进行完后，材料会变得比较软，此步可利于抗体进入材料。可根据材料的状况调整渗透时间，如果材料较难渗透时间可延长。在步骤(b)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法，其特征在于：所述方法不包括将待测植物的器官或组织制成切片的步骤；所述方法包括如下步骤：(a)将所述待测植物的器官或组织置于交联液中进行处理，所述交联液中含有能够与靶标激素交联从而形成半抗原的物质；(b)将经步骤(a)处理过的所述待测植物的器官或组织置于渗透液中进行处理，增加渗透性；(c)对经步骤(b)处理过的所述待测植物的器官或组织进行一抗孵育和二抗孵育，所用一抗为抗所述靶标激素的抗体，所用二抗为抗所述一抗的抗体，然后进行显色反应，从而实现在所述待测植物的器官或组织中对所述靶标激素的整体定位检测。

【技术特征摘要】
1.一种在植物器官或组织中对激素进行整体定位检测的方法，其特征在于：所述方法不包括将待测植物的器官或组织制成切片的步骤；所述方法包括如下步骤：(a)将所述待测植物的器官或组织置于交联液中进行处理，所述交联液中含有能够与靶标激素交联从而形成半抗原的物质；(b)将经步骤(a)处理过的所述待测植物的器官或组织置于渗透液中进行处理，增加渗透性；(c)对经步骤(b)处理过的所述待测植物的器官或组织进行一抗孵育和二抗孵育，所用一抗为抗所述靶标激素的抗体，所用二抗为抗所述一抗的抗体，然后进行显色反应，从而实现在所述待测植物的器官或组织中对所述靶标激素的整体定位检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述交联液的组成如下：每100mL所述交联液中含有3g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，余量为PBST；和/或步骤(a)中，将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液中进行处理是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述待测植物的器官或组织置于所述交联液中，2-8℃下黑暗中处理40-60分钟。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤(a)和步骤(b)之间还包括对所述待测植物的器官或组织进行固定和/或脱色素处理的步骤；所述固定是利用4％PFA多聚甲醛固定液对所述待测植物的器官或组织进行固定；所述脱色素处理是利用甲醇对所述待测植物的器官或组织进行脱色素。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述固定是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述待测植物的器官或组织置于4％PFA多聚甲醛固定液中，4℃固定12-16h；所述脱色素处理是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述待测植物的器官或组织依次置于如下溶液中进行梯度置换：(a1)2％PFA多聚甲醛固定液，20min；(a2)PBST，20min；2次；(a3)PBST中添加体积百分含量为25％的甲醇后所得溶液，20min；(a4)PBST中添加体积百分含量为50％的甲醇后所得溶液，20min；(a5)PBST中添加体积百分含量为75％的甲醇后所得溶液，20min；(a6)100％甲醇，直到所述待测植物的器官或组织由绿色变为无色为止；(a7)甲醇：乙醇依次按体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的比例混...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东辉，白书农，许智宏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11