一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法技术

本发明专利技术提供了一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC‑MS‑MS方法，包括以下步骤：用混合提取液对玉米分析样中六种霉菌毒素进行超声提取，加入复合净化剂净化，离心，膜过滤后，液相色谱串联质谱检测，采用含六种霉菌毒素标准品的空白玉米样品基质溶液建立标准曲线，基质匹配定量法定量。本方法可以一次性测定玉米中六种主要霉菌毒素，即DON、FB1、AFB1、T‑2、OTA和ZEN；方法定量限是国家限量值的1％～4％，完全可满足检测评价需要；方法精密度RSD≤15％,添加回收率满足《GB 23182‑2008饲料中兽药和其他化学物检测试验规程》的要求；和国家现行标准方法相比较，该方法高效、经济环保。

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法
本专利技术属于检测
，涉及玉米中黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、T-2毒素(T-2)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马毒素B1(FB1)六种主要霉菌毒素的测定方法，尤其涉及一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法。
技术介绍
玉米作为能量饲料原料，因其富含碳水化合物(占比约72％)而容易感染霉菌。刘凤芝等(2017)报道了60个玉米样品，玉米样品中黄曲霉毒素B1污染较轻，超标率为0，平均值为3.0μg/kg；脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染最严重，超标率达70.6％；玉米赤霉烯酮检出率为100％，平均值535.9μg/kg，超标率达31.58％。谢文梅等(2017)报道：81个玉米样品中三种毒素的检测结果为玉米样品中黄曲霉毒素B1污染相对较轻，检出率为88.89％，平均值为5.03μg/kg，超标率为0；玉米赤霉烯酮和呕吐毒素检出率为100％，含量的平均值分别78.42μg/kg和846.μg/kg，超标率分别为0和43.21％。刘凤芝和谢文梅都只测了玉米中的三种毒素，其实玉米也容易感染伏马毒素、T-2毒素和赭曲霉毒素。李思银等(2017)报道，34份玉米中六种霉菌毒素检测结果，检出率26/34，检出的有呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素FB1和OTA。目前，我国已经建立一些饲料中霉菌毒素检测标准，这包括GB/T30956—2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定(免疫亲和柱净化-高效液相色谱法)、NY/T1970—2010饲料中伏马毒素的测定(液质方法)、GB/T30957-2014饲料中赭曲霉毒素A的测定(免疫亲和柱净化-高效液相色谱法)和NY/T2071—2011[21]饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法。除NY/T2071—2011可同时检测三种霉菌毒素外，多数标准均为单次单种毒素检测方法,且免疫亲和柱多为进口，价格昂贵。现行国家标准检测方法存在检测效率低，检测成本高的缺点，有鉴于此，有必要提供一种成本低廉，能同时测定玉米中多种霉菌毒素的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法，该方法检测效率高，成本低，能满足国内玉米监测的需要。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法，其包括以下步骤：(1)提取称取玉米分析样于离心管中，加入混合提取液，涡旋混匀，振荡，进行超声提取；(2)净化对提取液进行离心处理，取上清液，加入复合净化剂进行净化，涡旋混匀，静置得净化液；(3)稀释取净化液加水稀释，涡旋，离心后过滤，待测；(4)基质匹配标准工作溶液的制备用六种霉菌毒素的标准品分别配制标准母溶液，再由标准母溶液配制混合储备液；吸取系列不同体积混合储备液于离心管中，氮气吹干得到质量混合标准系列；取空白玉米样品，按照步骤(1)(2)处理后得净化液，取净化液逐个加入到质量混合标准系列中，再加入超纯水稀释，接步骤(3)处理，得基质匹配标准工作溶液；(5)基质匹配定量法LC-MS-MS测定将步骤(4)中基质匹配标准工作溶液进行LC-MS-MS测定，根据检测结果绘制工作曲线；在相同条件下将步骤(3)中待测样品进行测定，将检测结果与工作曲线对照，得到样品液中六种霉菌毒素的含量，再计算得到样品中霉菌毒素的含量。所述步骤(1)中混合提取液为乙腈、水、甲酸，体积比为80：19：1。所述混合提取液的添加比例为每1g分析样加入5mL。作为优选，所述分析样的称样量为8g，混合提取液的添加量为40mL。所述步骤(1)中涡旋混匀时间为15～20s，振荡时间为10min～20min，超声提取时间为30～45min。优选地，所述步骤(1)中涡旋混匀时间为20s，振荡时间为10min，超声提取时间为30。所述步骤(2)中离心为在5000～8000r/min的条件下离心5～8min。优选地，所述步骤(2)中离心为在8000r/min的条件下离心5min。所述复合净化剂为七水硫酸镁和C18。作为优选，复合净化剂添加量为每2mL上清液加入180～200mg七水硫酸镁、110～130mgC18。更优选地，每2mL上清液加入190mg七水硫酸镁、120mgC18。所述步骤(2)中涡旋混匀时间为10～15s，静置时间为3～5min。所述步骤(3)中涡旋时间为10～15s。所述步骤(3)中离心为在12000～15000r/min的条件下离心5～8min。优选地，所述步骤(3)中离心为在15000r/min的条件下离心5min。所述步骤(3)中过滤为采用0.22μm尼龙滤膜过滤。所述步骤(5)中液相色谱柱为ODS柱，规格：3.0μm*150mm。所述步骤(5)中液相色谱流动相A为体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为含有5mM乙酸铵、体积分数0.1％甲酸的甲醇溶液。所述步骤(5)中液相色谱的流动相梯度洗脱程序为：0-1min，B5％；3min，B50％；8min，B75％；12min，B85％；13min，B90％；14min，B100％；15min，B5％；19min，B5％；进样量为10μL,液相流速为0.3mL/min。所述步骤(5)中质谱参数设置为采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，脱溶剂温度250℃；脱溶剂气和锥孔气均为N2，脱溶剂气流速15L/min；锥孔气流速3L/min。所述步骤(5)中质谱其它参数如下：本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本专利技术的测定方法选用了特定组成的混合提取液，可以对玉米中六种主要霉菌毒素进行一步提取，用复合净化剂净化后，采用适当的液相色谱和质谱参数，同时进行测定，形成一个整体性方案，实现同时测定玉米中六种主要霉菌毒素，节省了检测时间，提高了检测效率；(2)本专利技术采用自制复合吸附剂净化，替代现有的净化方式，无需昂贵免疫亲和柱或其它进口的多功能净化柱，也无需昂贵的同位素内标，因而大大降低了检测成本；(3)本专利技术中可以检测玉米中DON、FB1、AFB1、T-2、OTA和ZEN的定量限依次为：200、22、1、7、3、6μg/kg，远远低于国家限量值依次为：1000～5000、5000～60000FB1+FB2、10～30、500、100、500～1500μg/kg；方法精密度RSD≤15％,添加回收率满足《GB23182-2008饲料中兽药和其他化学物检测试验规程》的要求，检测能力能够满足国内监测的需要，方法高效、经济环保。附图说明图1为玉米样品总离子流图；图2为基质匹配标准工作溶液总离子流图；图3为DON的定量离子与定性离子丰度比；图4为FB1的定量离子与定性离子丰度比；图5为AFB1的定量离子与定性离子丰度比；图6为T-2的定量离子与定性离子丰度比；图7为OTA的定量离子与定性离子丰度比；图8为ZEN的定量离子与定性离子丰度比；图中标记如下：1-don+TIC(+)；2-黄曲毒霉素B1TIC(+)；3-伏马毒素B1TIC(+)；4-T-2TIC(+)；5-赭曲霉毒素ATIC(+)；6-玉米赤霉烯酮TIC(-)；7-don+297.00＞249.20(+)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC‑MS‑MS方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取称取分析样于离心管中，加入混合提取液，涡旋混匀，振荡，进行超声提取；(2)净化对提取液进行离心处理，取上清液，加入复合净化剂进行净化，涡旋混匀，静置得净化液；(3)稀释取净化液加水稀释，涡旋，离心后过滤，待测；(4)基质匹配标准工作溶液的制备用六种霉菌毒素的标准品配分别制标准母溶液，再由标准母溶液配制混合储备液；吸取系列不同体积混合储备液于离心管中，氮气吹干得到质量混合标准系列；取空白玉米样品，按照步骤(1)(2)处理后得净化液，取净化液逐个加入到质量混合标准系列中，再加入超纯水稀释，接步骤(3)处理，得基质匹配标准工作溶液；(5)基质匹配定量法LC‑MS‑MS测定将步骤(4)中基质匹配标准工作溶液进行LC‑MS‑MS测定，根据检测结果绘制工作曲线；在相同条件下将步骤(3)中待测样品进行测定，将检测结果与工作曲线对照，得到样品液中六种霉菌毒素的含量，再计算得到样品中霉菌毒素的含量。

【技术特征摘要】
1.一种同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取称取分析样于离心管中，加入混合提取液，涡旋混匀，振荡，进行超声提取；(2)净化对提取液进行离心处理，取上清液，加入复合净化剂进行净化，涡旋混匀，静置得净化液；(3)稀释取净化液加水稀释，涡旋，离心后过滤，待测；(4)基质匹配标准工作溶液的制备用六种霉菌毒素的标准品配分别制标准母溶液，再由标准母溶液配制混合储备液；吸取系列不同体积混合储备液于离心管中，氮气吹干得到质量混合标准系列；取空白玉米样品，按照步骤(1)(2)处理后得净化液，取净化液逐个加入到质量混合标准系列中，再加入超纯水稀释，接步骤(3)处理，得基质匹配标准工作溶液；(5)基质匹配定量法LC-MS-MS测定将步骤(4)中基质匹配标准工作溶液进行LC-MS-MS测定，根据检测结果绘制工作曲线；在相同条件下将步骤(3)中待测样品进行测定，将检测结果与工作曲线对照，得到样品液中六种霉菌毒素的含量，再计算得到样品中霉菌毒素的含量。2.根据权利要求1所述的同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合提取液为乙腈、水、甲酸，体积比为80：19：1。3.根据权利要求1所述的同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法，其特征在于，所述步骤(1)中涡旋混匀时间为15～20s，振荡时间为10～20min，超声提取时间为30～45min。4.根据权利要求1所述的同时测定玉米中六种霉菌毒素的LC-MS-MS方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心为在5000～8000r/...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷秋妙，吴维煇，王威利，林雪贤，张展，续倩，李亚菲，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农产品公共监测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44