一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用，涉及纳米生物传感器以及电化学检测领域。该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS2和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列。采用本发明专利技术电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1进行定量检测，具有操作简单、准确性高、检测范围广、灵敏度高、特异性强、稳定性高、重现性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用
本专利技术涉及纳米生物传感器以及电化学检测领域，具体涉及一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用。
技术介绍
真菌毒素是有毒真菌产生的次级代谢产物，极容易污染农作物产品。如果人们吃了被真菌毒素污染的食品，将对他们的身体造成严重的伤害甚至导致死亡。在一系列的真菌毒素中，黄曲霉毒素B1在食品中最频繁的被检测到，同时它的毒性也是最强的，这是由于它具有很强的与DNA和蛋白质的结合能力，可以破坏细胞。在致癌物里，黄曲霉毒素B1被国际癌症研究机构认定为一类致癌物。近年来，研究人员开发了色谱和免疫技术来检测黄曲霉毒素B1，其中包括高效液相色谱法、液相色谱与质谱联用法、酶联免疫吸附测定法、免疫传感法和比色免疫法。尽管这些方法具有较好的灵敏度，但是还存在一些不足之处，如对设备要求高费用大，对操作人员要求具备一定的知识背景和培训，对于小分子检测所需的抗体制备较为困难。在过去的十年里，研究人员开发了电化学适配体传感器用于检测黄曲霉毒素B1。与其它方法相比，电化学适配体方法展现出了优越的性能，如样品制备简单，所需设备费用不高，所需检测时间较短，但是现有电化学适配体传感器定量检测黄曲霉毒素B1的灵敏度和稳定性较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器及其应用，该电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1进行定量检测，具有操作简单、准确性高、检测范围广、灵敏度高、特异性强、稳定性高、重现性好等优点。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS2和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列。在本专利技术中，采用如下方法在金片电极表面修饰MoS2和纳米金的复合膜：(1)在金片电极表面形成三维SiO2纳米球阵列；(2)在所述三维SiO2纳米球阵列的间隙中沉积MoS2和纳米金的复合膜；(3)溶解所述三维SiO2纳米球阵列。在本专利技术中，步骤(2)中通过电沉积方法在所述三维SiO2纳米球阵列的间隙中沉积MoS2和纳米金的复合膜。在本专利技术中，所述电沉积方法中的电解液是含有HAuCl4·4H2O和(NH4)2MoS4的KCl溶液。其中HAuCl4·4H2O浓度为0.1-0.5mM，(NH4)2MoS4浓度为1-8mM，KCl溶液浓度为0.05-0.5M；优选的，HAuCl4·4H2O浓度为0.2mM，(NH4)2MoS4浓度为5mM，KCl溶液浓度为0.1M。进一步的，电沉积方法为恒电位法，其中电位为-1.5-0V，沉积电量为2.58-25.8mC；更进一步的，电位为-1V，沉积电量为18.7mC。在本专利技术中，步骤(1)中在金片电极表面形成三维SiO2纳米球阵列的方法如下：将金片电极插入SiO2分散液中，溶剂蒸发后，在电极表面形成三维SiO2纳米球阵列，然后煅烧。优选的技术方案中，采用氢氟酸溶解电极表面的三维SiO2纳米球阵列。在本专利技术中，所述DNA四面体是由四条寡核苷酸链A、B、C和D形成的，四条寡核苷酸链A、B、C和D的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-4所示，寡核苷酸链A、B、C的5’端均修饰有巯基；所述黄曲霉毒素B1适配体的序列如SEQIDNO:5所示。本专利技术还提供采用所述电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：将样品溶液滴加至所述电化学适配体传感器的工作电极表面进行反应，滴加信号探针进行反应；将所述工作电极、对电极和参比电极置于电解液中，采用差分脉冲伏安法，获得峰电流变化值的绝对值；根据以峰电流变化值的绝对值为应变量、AFB1浓度对数值的相反数为自变量的标准曲线，计算AFB1溶液的浓度。在本专利技术中，制作标准曲线的方法如下：将浓度在0.01fg/mL-1μg/mL范围内的AFB1溶液，滴加到工作电极表面进行反应，滴加信号探针进行反应；将电化学适配体传感器的工作电极、对电极和参比电极置于电解液中，采用差分脉冲伏安法，获得峰电流变化值的绝对值；以峰电流变化值的绝对值为应变量、以AFB1浓度对数值的相反数为自变量，制作标准曲线。在本专利技术中，所述信号探针是将辅助DNA和辣根过氧化物酶采用AuNPs-SiO2@Fe3O4标记后得到的；所述辅助DNA的核苷酸序列如SEQINNO:6所示、且3’端修饰了巯基；所述AuNPs-SiO2@Fe3O4是在SiO2@Fe3O4表面包裹了一层纳米金后得到的；所述电解液含有H2O2和硫堇。本专利技术电化学适配体传感器的工作电极是通过在金片电极表面依次修饰MoS2和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后构建得到的。当样品溶液中没有AFB1时，黄曲霉毒素B1适配体(APT)与DNA四面体(TDNs)杂交链能够稳定存在。当样品溶液中存在AFB1时，APT的构象发生改变，与AFB1牢固结合，并从杂交链上脱落下来。然后信号探针中的辅助DNA通过杂交反应连接到工作电极表面，通过HRP催化H2O2氧化硫堇产生电化学放大信号。溶液中AFB1的浓度越大，结合到电极表面的HRP越多，电化学放大信号越大。因此，可以采用本专利技术电化学适配体传感器定量检测黄曲霉毒素B1。本专利技术电化学适配体传感器可以通过改变适配体应用于其它真菌毒素的检测，具有普适性。实验结果证明，本专利技术用于检测黄曲霉毒素B1具有较高的灵敏度。当黄曲霉毒素B1浓度在0.1fg/mL-0.1μg/mL范围内，获得较好的线性关系，检测限低至0.01fg/mL。重复实验结果表明，本专利技术电化学适配体传感器检测黄曲酶毒素B1具有良好的重现性。特异性结果表明，本专利技术电化学适配体传感器除了黄曲酶毒素B1之外不会与其它四种真菌毒素(黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A)特异性结合，说明本专利技术传感器具有良好的特异性。稳定性结果分析表明，本专利技术传感器在4℃储存一个月，每隔五天对1pg/mL黄曲霉毒素B1溶液测试一次，发现响应电流没有明显的下降，一个月后仍然保持91％，说明本专利技术传感器具有良好的稳定性。本专利技术电化学适配体传感器检测大米和小麦粉末样品中黄曲霉毒素B1，结果与商用液质联用结果具有一致性。附图说明图1是本专利技术电化学适配体传感器检测原理示意图。图2是3DOMMoS2-AuNPs复合膜的SEM图。图3是3DOMMoS2-AuNPs复合膜的EDS图。图4是电化学适配体传感器对不同浓度的黄曲霉毒素B1测定的DPV图，其中vs.SCE表示电位相对于饱和甘汞参比电极。图5显示了采用本专利技术电化学适配体传感器检测不同浓度黄曲霉毒素B1获得的峰电流变化值的绝对值与黄曲霉毒素B1浓度对数值的相反数之间的线性关系。图6是采用本专利技术电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的特异性。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明：本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作步骤，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。本专利技术使用的材料与试剂：合成DNA四面体(TDNs)的四条寡核苷酸链A、B、C和D、黄曲霉毒素B1适配体(APT)、辅助DNA(he本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，其特征在于工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS2和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，该电化学适配体传感器为三电极体系传感器，其特征在于工作电极是在金片电极表面依次修饰MoS2和纳米金的复合膜、DNA四面体和黄曲霉毒素B1适配体后得到的；所述DNA四面体携带与黄曲霉毒素B1适配体部分互补的序列。2.根据权利要求1所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于采用如下方法在金片电极表面修饰MoS2和纳米金的复合膜：（1）在金片电极表面形成三维SiO2纳米球阵列；（2）在所述三维SiO2纳米球阵列的间隙中沉积MoS2和纳米金的复合膜；（3）溶解所述三维SiO2纳米球阵列。3.根据权利要求2所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于步骤（2）中通过电沉积方法在所述三维SiO2纳米球阵列的间隙中沉积MoS2和纳米金的复合膜。4.根据权利要求3所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于所述电沉积方法中的电解液是含有HAuCl4·4H2O和(NH4)2MoS4的KCl溶液。5.根据权利要求2-4之一所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于步骤（1）中在金片电极表面形成三维SiO2纳米球阵列的方法如下：将金片电极插入SiO2分散液中，溶剂蒸发后，在电极表面形成三维SiO2纳米球阵列，然后煅烧。6.根据权利要求5所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征在于采用氢氟酸溶解电极表面的三维SiO2纳米球阵列。7.根据权利要求6所述定量检测黄曲霉毒素B1的电化学适配体传感器，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓君，彭钢，黄和，李小燕，崔枫，仇倩颖，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32