致瘫痪水生有壳类动物毒素的分析制造技术

一种检测和／或测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素（ＰＳＴ）数量的方法，包括下述步骤：１）提供分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；２）将其与样品接触；３）测量样品中ＰＳＴ与所述分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白的结合；并且将结合量与样品中的ＰＳＴ的有无或样品中ＰＳＴ浓度相关联。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛤蚌毒素结合多肽，亲蛤蚌毒素蛋白(saxiphilin)的分离和纯化，以及应用纯化的亲蛤蚌毒素蛋白用来检测、富集、纯化和提取蛤蚌毒素的方法、分析和装置。特别是本专利技术涉及一种经济、耐用(robust)、高通量的分析方法，其不需要放射性标记的试剂，适合现场使用。
技术介绍
致瘫痪的水生有壳类动物中毒由摄取含来自腰鞭毛虫的毒素的鱼，水生有壳类动物或软体动物引起，由于导致严重的人类疾病，通常导致死亡，目前成为一个世界范围问题。中毒由致瘫痪水生有壳类动物毒素(PSTs)引起，其属于原型分子蛤蚌毒素(STX)相关毒素家族。并且，有毒淡水海藻的繁盛能以相同神经毒素污染供水，可以引起致瘫痪的水生有壳类动物中毒。这种毒素污染的水会给人，牲畜以及野生动物造成可怕的后果。PSTs的一般结构如下 毒素家族可分成3大类蛤蚌毒素(saxitoxins)，高强活性神经毒素，并且没有被硫酸酯化；gonyautoxin(GTXs)，为单硫酸酯化；以及N-磺基氨基甲酰-11-硫酸氢盐(hydrosulphate)C-毒素，其毒性小于STXs或GTXs。PSTs毒性源自其与电压依赖性钠通道的结合，其阻断钠离子的内流，因此阻断神经肌肉的传输。这导致呼吸麻痹，目前没有有效的治疗措施。在一些爆发的致瘫痪的水生有壳类动物中毒事件中，40％以上的受害者已经死亡。PSTs与河豚毒素具有完全不同的结构，但却结合到钠通道的相同位点(Hall等，1990)。在一些场合下，河豚毒素可与PSTs一起发生作用，因此任何用于检测PSTs的分析必须能够将其与河豚毒区分开。腰鞭毛虫，是PSTs的源头，周期性地形成海藻繁盛，也就是闻名的赤潮(Anderson，1994)。软体动物，鱼，以及水生有壳类动物，包括有商业意义或使用水产技术养殖的物种，可能会吞食腰鞭毛虫从而聚集毒素。不可能检测对每一只海产动物进行检测判断是否包含毒素，因此就存在人类由于不注意而食用包含毒素的动物的风险。因此就需要监控人类消费的物种中存在的PSTs，以避免中毒的危险以及预防社会及经济损失。目前已经知道有超过20种蛤蚌毒素的天然类似物，以及它们对哺乳动物的毒性。一些天然存在的PSTs列在表1中。表1一些天然存在的PSTs 海藻繁盛的发生在全球出现上升的态势，可能是沿海水超营养作用增加及全球变暖的结果，结果导致致瘫痪的水生有壳类动物中毒或水生有壳类动物或带PSTs其他生物污染的发生率也上升。例如，单在2000年，在马来西亚的沙巴就有四人中毒，甲壳类渔业停业四个月。在菲律宾的马尼拉湾，甲壳类渔业停业数月；在华盛顿州，9人中毒并且5人需要住院治疗，在2000年Cape Cod和南缅因州的甲壳类渔业也遭停业数月，这两起事件都发生在美国；2000年5月，新西兰North Island的西海岸的所有甲壳类渔业由于海藻繁盛，都遭停止，其逼近绿色环绕的(greenlipped)蚌类产区，每年产生价值8千4百万新元的蚌类；在苏格兰在2000年6月甲壳类渔业被禁止；并且海藻繁盛导致在南非和中国发生不少致瘫痪的水生有壳类动物中毒事件；加拿大2000年7月检测到的污染结果，是将3000条养殖的大麻哈鱼(salmon)消灭。特别是，在美国，在过去的10年内发生了约150起水生有壳类动物污染事件，导致甲壳类渔业最长达12个月的停顿；在苏格兰的一些地方，停业达3年之久；1994在摩洛哥，导致4人死亡，74人住院接受治疗；在菲律宾自1983年已有约1600人中毒，而在1983年之前，几乎没有此类事件的发生；1997年在印度爆发了一次，导致7人死亡，500人住院接受治疗，禁止甲壳类渔业导致1000户家庭失去工作。不幸地，尽管急需简单、耐用及可靠的方法来检测人类食用的海洋生物的中污染，现有方法却不能令人满意。急需常规的水生有壳类动物检测方法以保证有毒产品不进入市场(VanEgmond和Dekker，1995)。目前，唯一获得官方认可的方法是小鼠致死生物分析方法，由官方分析化学家联合会(AOAC)批准官方分析方法，959.08E部分，1990。这种方法需要对小鼠腹膜内注射潜在的毒性生物体例如水生有壳类动物的盐酸提取物，并且观察从注射到死亡的时间(Sommer和Meyer，1937；Hungerford，1995)。小鼠必须来自小鼠群体，定期地参考毒素样品对其灵敏度进行标准化，并且样品必须进行稀释以保证死亡在5～7分钟内发生。该分析方法不人道、昂贵、不普及，由于动物保护条例也冒着被禁止的风险，特别是在有些国家如欧盟，荷兰和德国。更值得关注的是小鼠生物分析方法的灵敏度只有180μg STX/1(Johnson和Mulberry，1966)。使用灵敏度较差的方法意味着存在着下列严重危险可能检测不出足以引起人中毒的PSTs水平。例如，菲律宾的儿童由于食用水生有壳类动物而死亡，但小鼠致死生物分析表明水生有壳类动物只含40μg STX/100g水生有壳类动物肉，将由于提取溶剂以及水生有壳类动物的稀释作用考虑在内，其约等于约200μg。该毒性水平与小鼠致死生物分析的检测限相同。该问题导致人们致力于开发替代分析方法的尝试，基于(a)用生物观察的方法检测中毒生物的存在，(b)利用如DNA探针的方法进行原位检测，或 (c)用生化，生理或化学分析检测海洋生物中的毒素。一种方法利用阻滞电压门控(voltage-gated)钠通道(VGSC)原理来进行检测，后者为兴奋细胞中大跨膜蛋白，当其响应细胞电位差的改变而开启的时候，导致离子通过中孔(central pore)(参见如Doucette等，1997；Jellett等，1992；Vieytes等，1993)。这些分析都基于放射配体分析方法(Weigele和Barchi，1978)，可以改成微量滴定板形式，以增加样品通量(Doucette等，1997)。也可以使用强刺激(hyperstimulated)细胞培养以增加通过钠通道的离子流量(Jellett等，1992；美国专利5,420,011和5,858,687)。但是，这些分析方法费用昂贵且技术复杂，需要放射性标记的试剂或细胞培养。并且对pH波动敏感，因为在pH大于6.7时，PSTs很容易被从离子通道上替换下来，类似地，也对阳离子浓度敏感，并且，更重要地，由于它们也能检测河豚毒素，为非特异的方法。这些方法中没有一种方法适合现场使用。化学分析方法由于下列事实而变得复杂每种毒素在结构上千变万化，从强极性到亲脂性，从低分子量到大分子量。而且，那些化学方法需要用已知毒素的标准样品，且不能用这些方法测量任何一种新的生物活性的PSTs。因此基于抗体检测或用化学方法如高效液相色谱，质谱，或毛细管电泳的分析方法不能检测广谱的毒素。一种简单快速初步纯化(clean-up)水生有壳类动物粗提物的方法与长形工作台(bench)或桌面(desktop)侧流(lateral flow)免疫色谱分析方法(由JellettBiotek销售)联用，可以在10分钟内得到初步的结果；但是，需要用液相色谱-质谱来确证筛选的结果。初步纯化用甲酸铵流动相在适和亲脂性毒素分离的5cm固相柱上进行，接着用60-90％梯度的四腈(te本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测和／或测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素（ＰＳＴ）量的方法，包括下列步骤：１）提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；２）将其与样品接触；３）测量ＰＳＴｓ与分离的亲蛤蚌毒素蛋白的结合量；以及　 　４）将结合量与样品中的ＰＳＴｓ的有无或样品中ＰＳＴ浓度相关联。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：林登E卢埃林，詹姆斯N伯内尔，锡德里克罗比洛特，
申请(专利权)人：澳大利亚海洋科学研究院，詹姆斯库克大学，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]