本发明专利技术属于比色生物传感器构建领域，提供了一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，技术方案为：步骤1、四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备；步骤2、pH分辨比色生物传感器构建。本发明专利技术构建的pH分辨比色生物传感器能够为多目标检测提供了一种简单，快速，准确和低成本的策略。
【技术实现步骤摘要】
一种pH分辨比色生物传感器构建的方法
本专利技术属于比色生物传感器构建领域，具体涉及一种构建简单、准确、低成本和用于多目标物同时检测的pH分辨比色生物传感器的方法。
技术介绍
比色传感由于具有成本低，携带方便，操作简单等优点，已经在日常生活中广泛应用于各种目标检测，例如：DNA，蛋白质，细胞，毒素，重金属离子等等。主要原因比色传感不需要复杂的仪器，目标的量化可以通过肉眼来实现,所以它非常适合于测试点或现场测试。对于比色传感器，目前的设计主要是基于单一的颜色变化，严重限制了多目标物检测的能力。到目前为止，关于能够实现多目标物检测的比色生物传感器的报道很少。变色染料也可以用作多色检测的信号指示剂。因此，多目标物检测的问题可以通过使用多个不同波长信号指示剂被部分解决。但是可见光是电磁波谱的窄带(大约400-700nm)。因此，由于光谱重叠，多色的共存会相互干扰。当三种以上颜色混合在一起时，人眼的识别能力不能辨别不同颜色的比例和浓度。所以这个策略只适用于两三个目标的检测。考虑到进一步利用波长区分色彩的潜力是有限的，自然而然地想到一个新的维度，如时间和电势，作为控制措施，使色彩显得有序是必要的。在这种情况下，两个信号指示器甚至具有相同的颜色，可以应用于双目标检测，因为它们在上分离。真菌毒素对食品的全球污染是一个主要问题，因为它们对人类，动物和农作物造成不利影响，导致疾病和经济损失。因此，食品安全作为全球性问题日益突出。
技术实现思路
本专利技术利用四种变色染料为信号指试剂，引入pH值作为新的维度，克服染料间的相互干扰，开发了pH分辨比色生物传感器，旨在专利技术一种集简单，快速，准确，低成本等优点为一体的pH分辨比色生物传感器直接同时检测赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)。两种变色染料的颜色只能在酸性条件下采集，而另外两种只能在碱性条件下采集。四个目标的浓度可以通过调整pH值依次获得。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，步骤如下：步骤1、四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)制备步骤1、首先50mL氧化石墨烯水溶液超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁和硫酸亚铁混合溶液，搅拌12h。剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，90℃下反应1.5h,后冷却至室温。用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤至中性，定容与100mL存于4℃下备用。所述氧化石墨烯浓度为0.8mg/mL。所述三氯化铁和硫酸亚铁的质量分别为0.055g，0.048g。所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02-0.2M。步骤2、pH分辨比色生物传感器构建：步骤2a、移取氧化石墨烯(GO)水溶液，超声2-4h；加入溶有DNA1的磷酸盐缓冲溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次；加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液和酚酞(PP)的乙醇溶液，振荡2～3h；离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到PP-DNA1-GO，加入和氧化石墨烯水溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和酚酞的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。用孔雀石绿MGCB替代步骤2a的PP，用DNA3替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MGCB-DNA3-GO；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和孔雀石绿的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。用百里酚酞TP替代步骤2a的PP，用DNA5替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到TP-DNA5-GO；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和百里酚酞的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。用甲基紫MV替代步骤2a的PP，用DNA7替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MV-DNA7-GO；其中，氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和甲基紫的乙醇溶液体积比为1：0.9：0.1。步骤2b、同时移取步骤1制备的Fe3O4/GO溶液，加入溶有DNA2的磷酸盐缓冲溶液溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到DNA2-Fe3O4/GO，加入和Fe3O4/GO溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；用DNA4替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA4-Fe3O4/GO；用DNA6替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA6-Fe3O4/GO；用DNA8替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA8-Fe3O4/GO；步骤2c、按体积比1:1移取PP-DNA1-GO和DNA2-Fe3O4/GO混合得混合液一，接着加入目标物赭曲霉素A适配体(OTAaptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到PP-DNA1-GO-OTAaptamer-DNA2-Fe3O4/GO，加入和混合液一等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；其中，混合液一和目标物赭曲霉素A适配体的体积比为20:1；同时按体积比1:1移取MGCB-DNA3-GO和DNA4-Fe3O4/GO混合得混合液二，接着加入目标物黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO，加入和混合液二等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；其中，混合液二和目标物黄曲霉毒素B1适配体的体积比为20:1；同时按体积比1:1移取TP-DNA5-GO和DNA6-Fe3O4/GO混合得混合液三，接着加入目标物伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，加入和混合液三等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；其中，混合液三和目标物伏马菌素B1适配体的体积比为20:1；同时按体积比1:1移取MV-DNA7-GO和DNA8-Fe3O4/GO混合得混合液四，接着加入目标物微囊藻毒素LR适配体(MC-LRaptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MV-DNA7-GO-MC-LRaptamer-DNA8-Fe3O4/GO，加入和混合液四等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；其中，混合液四和目标物微囊藻毒素LR适配体的体积比为20:1；步骤2d、分别移取步骤2c中的PP-DNA1-GO-OTAaptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/G，TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，MV-DNA7-GO-MC-LRaptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离移去上清液；接着分别对应滴加浓度从5ng/mL到500ng/mL的目标物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，步骤如下：步骤1、制备四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)，备用；步骤2、pH分辨比色生物传感器构建：步骤2a、移取氧化石墨烯(GO)水溶液，超声2‑4h；加入溶有DNA1的磷酸盐缓冲溶液，振荡22‑24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次；加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液和酚酞(PP)的乙醇溶液，振荡2～3h；离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到PP‑DNA1‑GO，加入和氧化石墨烯水溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；用孔雀石绿MGCB替代步骤2a的PP，用DNA3替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MGCB‑DNA3‑GO；用百里酚酞TP替代步骤2a的PP，用DNA5替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到TP‑DNA5‑GO；用甲基紫MV替代步骤2a的PP，用DNA7替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MV‑DNA7‑GO；步骤2b、同时移取步骤1制备的Fe3O4/GO溶液，加入溶有DNA2的磷酸盐缓冲溶液溶液，振荡22‑24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到DNA2‑Fe3O4/GO，加入和Fe3O4/GO溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；用DNA4替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA4‑Fe3O4/GO；用DNA6替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA6‑Fe3O4/GO；用DNA8替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA8‑Fe3O4/GO；步骤2c、按体积比1:1移取PP‑DNA1‑GO和DNA2‑Fe3O4/GO混合得混合液一，接着加入目标物赭曲霉素A适配体(OTA aptamer)振荡10‑12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到PP‑DNA1‑GO‑OTA aptamer‑DNA2‑Fe3O4/GO，加入和混合液一等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；同时按体积比1:1移取MGCB‑DNA3‑GO和DNA4‑Fe3O4/GO混合得混合液二，接着加入目标物黄曲霉毒素B1适配体(AFB1 aptamer)振荡10‑12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MGCB‑DNA3‑GO‑AFB1 aptamer‑DNA4‑Fe3O4/GO，加入和混合液二等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；同时按体积比1:1移取TP‑DNA5‑GO和DNA6‑Fe3O4/GO混合得混合液三，接着加入目标物伏马菌素B1适配体(FB1 aptamer)振荡10‑12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到TP‑DNA5‑GO‑FB1 aptamer‑DNA6‑Fe3O4/GO，加入和混合液三等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；同时按体积比1:1移取MV‑DNA7‑GO和DNA8‑Fe3O4/GO混合得混合液四，接着加入目标物微囊藻毒素LR适配体(MC‑LR aptamer)振荡10‑12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MV‑DNA7‑GO‑MC‑LR aptamer‑DNA8‑Fe3O4/GO，加入和混合液四等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；步骤2d、分别移取步骤2c中的PP‑DNA1‑GO‑OTA aptamer‑DNA2‑Fe3O4/GO，MGCB‑DNA3‑GO‑AFB1 aptamer‑DNA4‑Fe3O4/G，TP‑DNA5‑GO‑FB1 aptamer‑DNA6‑Fe3O4/GO，MV‑DNA7‑GO‑MC‑LR aptamer‑DNA8‑Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离移去上清液；接着分别对应滴加浓度从5ng/mL到500ng/mL的目标物赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC‑LR)的混合液，磁分离后通过改变上清液和沉淀物的pH值按浓度进行比色分析。...
【技术特征摘要】
1.一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，步骤如下：步骤1、制备四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物(Fe3O4/GO)，备用；步骤2、pH分辨比色生物传感器构建：步骤2a、移取氧化石墨烯(GO)水溶液，超声2-4h；加入溶有DNA1的磷酸盐缓冲溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次；加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液和酚酞(PP)的乙醇溶液，振荡2～3h；离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤三次，得到PP-DNA1-GO，加入和氧化石墨烯水溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；用孔雀石绿MGCB替代步骤2a的PP，用DNA3替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MGCB-DNA3-GO；用百里酚酞TP替代步骤2a的PP，用DNA5替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到TP-DNA5-GO；用甲基紫MV替代步骤2a的PP，用DNA7替代步骤2a的DNA1，反应条件和步骤2a一致；得到MV-DNA7-GO；步骤2b、同时移取步骤1制备的Fe3O4/GO溶液，加入溶有DNA2的磷酸盐缓冲溶液溶液，振荡22-24h，离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到DNA2-Fe3O4/GO，加入和Fe3O4/GO溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；用DNA4替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA4-Fe3O4/GO；用DNA6替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA6-Fe3O4/GO；用DNA8替代步骤2b的DNA2，条件和步骤2b一致，得到DNA8-Fe3O4/GO；步骤2c、按体积比1:1移取PP-DNA1-GO和DNA2-Fe3O4/GO混合得混合液一，接着加入目标物赭曲霉素A适配体(OTAaptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到PP-DNA1-GO-OTAaptamer-DNA2-Fe3O4/GO，加入和混合液一等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；同时按体积比1:1移取MGCB-DNA3-GO和DNA4-Fe3O4/GO混合得混合液二，接着加入目标物黄曲霉毒素B1适配体(AFB1aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/GO，加入和混合液二等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；同时按体积比1:1移取TP-DNA5-GO和DNA6-Fe3O4/GO混合得混合液三，接着加入目标物伏马菌素B1适配体(FB1aptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，加入和混合液三等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；同时按体积比1:1移取MV-DNA7-GO和DNA8-Fe3O4/GO混合得混合液四，接着加入目标物微囊藻毒素LR适配体(MC-LRaptamer)振荡10-12h，磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤数次，得到MV-DNA7-GO-MC-LRaptamer-DNA8-Fe3O4/GO，加入和混合液四等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液保存于2～4℃下备用；步骤2d、分别移取步骤2c中的PP-DNA1-GO-OTAaptamer-DNA2-Fe3O4/GO，MGCB-DNA3-GO-AFB1aptamer-DNA4-Fe3O4/G，TP-DNA5-GO-FB1aptamer-DNA6-Fe3O4/GO，MV-DNA7-GO-MC-LRaptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合，磁分离移去上清液；接着分别对应滴加浓度从5ng/mL到500ng/mL的目标物赭曲霉素A(OTA)，黄曲霉毒素B1(AFB1)，伏马菌素B1(FB1)和微囊藻毒素LR(MC-LR)的混合液，磁分离后通过改变上清液和沉淀物的pH值按浓度进行比色分析。2.一种pH分辨比色生物传感器构建的方法，其特征在于，步骤1、首先50mL氧化石墨烯水溶液超声1h，通氮气30min；之后氮气保护下，逐滴加入50mL的三氯化铁和硫酸亚铁混合溶液，搅拌12h，剧烈搅拌，将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0，9...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝楠，王坤，周舟，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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