用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。本发明专利技术根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明专利技术在上述268对引物中筛选获得106对具有差异效果的引物。本发明专利技术进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建中棉所50的特异指纹图谱。本发明专利技术还公开了所述SSR引物在构建中棉所50指纹图谱以及鉴定中棉所50中的应用。本发明专利技术所述SSR引物及所构建的指纹图谱对中棉所50的品种鉴定与推广等具有重要价值。

【技术实现步骤摘要】
用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用
本专利技术涉及用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物，还涉及所述SSR引物在中棉所50鉴定以及构建中棉所50指纹图谱中的应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。
技术介绍
中棉所50是由中国农科院棉花所早熟课题组育种专家所培育的，2007年通过国家审定，在早熟品种中推广面积较大。棉花国家区试自2012年始，重新开启棉花早熟组试验，中棉所50作为对照品种入选，至今已有5年。但在试验及推广过程中，经常发现有数量不等的杂株存在。这一方面干扰了国家早熟区域试验的正常进行，一方面也可能给广大棉农带来经济上的损失。以往鉴定中棉所50的纯度，主要以田间鉴定为主，费时费工。DNA分子标记的出现和快速发展，为中棉所50的准确鉴定提供了一种新的技术手段。简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)分子标记具有数量丰富、共显性遗传、信息含量高、分析方法简单、结果重现性好等优点，使其成为构建品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于大豆、玉米、小麦、水稻、棉花等作物中。在被子植物中，卵子和精子核融合形成二倍体的合子，最终发育成胚；受精事件诱发母体的二倍体珠心细胞分化成种皮。因此，棉籽种皮是全部继承母本遗传信息的组织，通过分离种皮并从中提取DNA、构建指纹图谱，能够获得母本的指纹；棉籽种仁基本成分则是由卵子和精子核融合形成的二倍体种胚。结合二倍体种胚和母本指纹，就可分析推算该棉花品种是常规种，还是杂交种。早期已有花生、玉米等种皮DNA提取方法的报道(赵久然,刘龙洲,王凤格等.利用杂交玉米F1代种子果皮组织鉴定母本真实性的SSR研究[J].玉米科学，2004，12(3):6-8；刘龙洲.自玉米F1种子获得父本、母本全套DNA指纹图谱的研究[D].新疆农业大学，2004；石运庆,苗华荣,陈高等.花生种皮及籽仁DNA提取方法的研究[J].花生学报，2008,37(4)：37-39.)。棉花的相关报道目前还较少见。为了快速鉴定中棉所50，特采用目前常用的SSR检测技术，对中棉所50同时进行种皮DNA及种胚DNA的双重鉴定，构建指纹图谱，以确保中棉所50的品种纯度。但这种方法存在成本偏高、耗时、且一次检测位点较为有限等不足。因此，开发一种利用专用引物组快速鉴定棉花品种中棉所50的方法，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物；本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供所述的SSR引物在中棉所50鉴定以及构建中棉所50指纹图谱中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术根据GenBankdbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cottonmarkerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行了陆地棉SSR引物的设计，并根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得268对引物。本专利技术利用中棉所6个杂交种的6对亲本，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物(表现形式主要以条带长度不一致)，在总引物中占据了40％的比例，证明本专利技术所述SSR引物具有一定的多态性。本专利技术进一步通过对中棉所12个亲本样本进行SSR扩增反应，对上述106对引物在12个亲本品种中具有差异效果的特异SSR标记进行筛选。最终，本专利技术从上述106对具有疑似差异扩增效果的引物中，选择出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种中棉所50的特异指纹图谱。本专利技术所述的15对核心SSR引物及一对Bt基因特异引物，包括：由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的下游引物组成的引物对1(即引物M003)；由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的下游引物组成的引物对2(即引物M006)；由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.6所示的下游引物组成的引物对3(即引物M009)；由核苷酸序列为SEQIDNo.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.8所示的下游引物组成的引物对4(即引物M017)；由核苷酸序列为SEQIDNo.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.10所示的下游引物组成的引物对5(即引物M036)；由核苷酸序列为SEQIDNo.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.12所示的下游引物组成的引物对6(即引物M037)；由核苷酸序列为SEQIDNo.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.14所示的下游引物组成的引物对7(即引物M068)；由核苷酸序列为SEQIDNo.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.16所示的下游引物组成的引物对8(即引物M077)；由核苷酸序列为SEQIDNo.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.18所示的下游引物组成的引物对9(即引物M084)；由核苷酸序列为SEQIDNo.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.20所示的下游引物组成的引物对10(即引物Q024)；由核苷酸序列为SEQIDNo.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.22所示的下游引物组成的引物对11(即引物Q042)；由核苷酸序列为SEQIDNo.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.24所示的下游引物组成的引物对12(即引物Q055)；由核苷酸序列为SEQIDNo.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.26所示的下游引物组成的引物对13(即引物Q076)；由核苷酸序列为SEQIDNo.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.28所示的下游引物组成的引物对14(即引物Q129)；由核苷酸序列为SEQIDNo.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.30所示的下游引物组成的引物对15(即引物Q178)；以及，由核苷酸序列为SEQIDNo.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.32所示的下游引物组成的引物对16(即Bt基因特异引物)。本专利技术进一步公开了所述的SSR引物在构建中棉所50指纹图谱中的应用。本专利技术进一步公开了所述的SSR引物在鉴定中棉所50中的应用。本专利技术还公开了一种中棉所50指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样本中棉所50的种皮、种胚基因组DNA；(2)分别以提取的种皮、种胚基因组DNA为模板，以本专利技术所述16对SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建得到中棉所50的DNA指纹图谱。优选的，所述中棉所50指纹图谱的构建方法中，步骤(3)按照引物对1(即M003)、引物对2(即M006)、引物对3(即M009)、引物对4(即M017)、引物对5(即M036)、引物对6(即M037)、引物对7(即M068)、引物对8(即M077)、引物对9(即M084)、引物对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物，其特征在于，包括：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对1；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的下游引物组成的引物对2；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的下游引物组成的引物对3；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的下游引物组成的引物对4；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的下游引物组成的引物对5；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.12所示的下游引物组成的引物对6；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的下游引物组成的引物对7；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的下游引物组成的引物对8；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.18所示的下游引物组成的引物对9；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.20所示的下游引物组成的引物对10；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.22所示的下游引物组成的引物对11；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.24所示的下游引物组成的引物对12；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.26所示的下游引物组成的引物对13；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.28所示的下游引物组成的引物对14；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.30所示的下游引物组成的引物对15中的任意一对或多对；以及，由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.32所示的下游引物组成的引物对16。...

【技术特征摘要】
1.用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物，其特征在于，包括：由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的下游引物组成的引物对1；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的下游引物组成的引物对2；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.6所示的下游引物组成的引物对3；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.8所示的下游引物组成的引物对4；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.10所示的下游引物组成的引物对5；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.12所示的下游引物组成的引物对6；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.14所示的下游引物组成的引物对7；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.16所示的下游引物组成的引物对8；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.18所示的下游引物组成的引物对9；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.20所示的下游引物组成的引物对10；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.22所示的下游引物组成的引物对11；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.24所示的下游引物组成的引物对12；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.26所示的下游引物组成的引物对13；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.28所示的下游引物组成的引物对14；或者，由核苷酸序列为SEQIDNo.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.30所示的下游引物组成的引物对15中的任意一对或多对；以及，由核苷酸序列为SEQIDNo.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo.32所示的下游引物组成的引物对16。2.权利要求1所述的SSR引物在构建中棉所50指纹图谱中的应用。3.权利要求1所述的SSR引物在鉴定中棉所50中的应用。4.一种中棉所50的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测棉花品种的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果PCR扩增产物满足以下标准1)至标准16)中的任意14条以上标准，则判定待测棉花品种为中棉所50或候选的中棉所50；其中，标准1)：采用所述引物对1时，满足如下带型：大于400bp具有1条弱带、在300bp和100bp之间具有3条亮带；标准2)：采用所述引物对2时，满足如下带型：在600bp和500bp之间具有2条亮带、在500bp和400bp之间具有1条较弱带、在400bp和300bp之间具有2条亮带；标准3)：采用所述引物对3时，满足如下带型：在500bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有2条亮带；标准4)：采用所述引物对4时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条亮带、在200bp以下具有1条粗带；标准5)：采用所述引物对5时，满足如下带型：在300bp以上无带、在300bp和200bp之间具有1条粗带；标准6)：采用所述引物对6时，满足如下带型：在400bp以上可能具有2条弱带、在300bp和200bp之间仅具有1条亮带；标准7)：采用所述引物对7时，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逢举，彭军，刘媛，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41