一种哈维氏弧菌快速检测方法技术

本发明专利技术提供一种哈维氏弧菌快速检测方法，其中使用的正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术所提供的检测方法能够在20min内完成样品的检测，相比于其他检测技术，反应时间大大缩短；经特异性实验验证，本发明专利技术所提供的引物、探针和检测方法在其他弧菌属细菌如副溶血弧菌、创伤弧菌和河流弧菌等，及铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌3种常见致病菌均无交叉反应，只有哈维氏弧菌模式菌株和分离株才出现阳性扩增。使用结果表明本发明专利技术所建立的检测方法灵敏度高、重复性好，操作简单，检测速度快、成本低。

A rapid detection method for Vibrio harveyi

The present invention provides a rapid detection method for Vibrio harveyi, in which the nucleotide sequence of forward primer is SEQ ID NO:1, the nucleotide sequence of reverse primer is SEQ ID NO:2, and the nucleotide sequence of probe is SEQ ID NO:3. The detection method provided by the invention can complete the sample detection within 20 minutes, and the reaction time is greatly shortened compared with other detection techniques. The specificity test proves that the primers, probes and detection methods provided by the invention can be used in other Vibrio bacteria such as Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, etc., and Pseudomonas aeruginosa. There was no cross-reaction among the three common pathogenic bacteria, including Aeromonas hydrophila, Aeromonas hydrophila and Pseudomonas fluorescens. The application results show that the method has high sensitivity, good repeatability, simple operation, fast detection speed and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种哈维氏弧菌快速检测方法
本专利技术属于病害微生物检测
，具体涉及一种哈维氏弧菌的快速检测方法。
技术介绍
弧菌(Vibrio)病是造成鱼、虾、贝类危害较为严重的细菌性疾病之一,水产养殖业常因其遭受巨大的经济损失。它是属于一种典型的条件致病菌，当外界水体环境恶化，各种因素造成水生动物抵抗力下降时，致病弧菌会迅速繁殖，导致水生动物感染弧菌病。哈维氏弧菌(Vibrioharvey)是一种具鞭毛，呈弧状的革兰氏阴性菌，部分可发光。广泛分布于岸边温度较高的水域，附着于海洋生物的体表和海洋沉积物等，既是一种正常的菌群，同时也是重要的海洋致病菌。近年来我国渔业的不断发展，水产疾病日益突出。尤其在竞争大环境下，大规模高密度的养殖方式被广泛使用，水产疾病发生频率进一步提高，损失尤为严重。哈维氏弧菌作为鱼、虾、贝类养殖业主要病原体之，寻找出一种适合养殖基地，可进行实地检测哈维氏弧菌的手段，对于填补这一市场缺口有重大意义。然而传统的哈维氏弧菌检测方法，例如选择性培养基和生理生化试验检测，尽管也能检测出病原体，但是费力、费时和低灵敏度等缺点使得其不能满足病害防治的要求。
技术实现思路
本专利技术提供一种哈维氏弧菌快速检测方法，能够快速的检测哈维氏弧菌，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种非疾病诊断治疗目的的检测哈维氏弧菌的方法，所述的方法包括如下的步骤：1)准备待检测菌的核酸样品提取待检测菌的基因组DNA作为扩增样品备用；2)构建Real-timeRPA反应体系体系将用于扩增哈维氏弧菌目的基因的正向引物和反向引物和RPA探针加入到重组酶聚合酶扩增(RPA)体系中，再加入步骤1)制备的核酸样品；加入冻干酶粉，混匀后，转移到PCR管中，加入启动剂MgAc后进行荧光定量反应；采集荧光信号,判断是否形成扩增曲线，以扩增曲线存在与否判定是否存在哈维氏弧菌。所述的正向引物，其核苷酸序列如下：5′-AATCATCGTGTTAGTTGCCCTGCTACTTCCTGTTG-3′(35bp)(SEQIDNO:1)反向引物，其核苷酸序列如下：5′-TGTTTAATTGAGGGTGGTTGATCGGTGTCAT-3′(31bp)(SEQIDNO:2)；所述的RPA探针，其核苷酸序列如下(SEQIDNO:3)：5′-CCCTGCAGAATCACAATTTCGTCAAATTGGTGAATATCACAACGTGCCAG-3′(50bp)；其中探针序列个别碱基进行了修饰，第31位胸腺嘧啶T的标记物为FAM，第33位腺嘌呤A由四氢呋喃(THF)替换，第35位胸腺嘧啶T标记物为BHQ，3′端进行C3Spacer修饰。所述的荧光定量反应，其反应条件如下：恒等温37℃温度下30s为一个循环，共40个循环。本专利技术所使用的引物和探针，可用于制备检测哈维氏弧菌的制品。本专利技术所提供的检测方法能够在20min内完成样品的检测，相比于其他检测技术，反应时间大大缩短；经特异性实验验证，本专利技术所提供的引物、探针和检测方法在其他弧菌属细菌如副溶血弧菌、创伤弧菌和河流弧菌等，及铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌3种常见致病菌均无交叉反应，只有哈维氏弧菌模式菌株和分离株才出现阳性扩增。使用结果表明本专利技术所建立的检测方法灵敏度高、重复性好，操作简单，检测速度快、成本低，不需要特殊的仪器设备和实验条件，设备便携，广泛适合于哈维氏弧菌的POCT。附图说明图1：引物筛选结果图；图2：温度优化结果图；图3：探针浓度优化结果图4：特异性检测结果图，其中：1.哈维氏弧菌CGMCC1.15992.哈维氏弧菌NBV2693.哈维氏弧菌10-S54.哈维氏弧菌9-S295.鳗利斯顿氏菌6.创伤弧菌7.河流弧菌8.荧光假单胞菌9.迟缓型爱德华氏菌10.副溶血弧菌11。铜绿假单胞菌12.嗜水气单胞菌NTC.阴性对照；图5：灵敏度检测结果图；图6：Real-timeRPA检测方法重复性实验结果图。具体实施方式申请人以哈维氏弧菌的toxR(toxinregulator)基因为靶基因，在该基因的保守区域上选取合适片段设计探针并在其两边设计多对引物，多次优化，建立一套快速检测哈维氏弧菌的Real-timeRPA方法。本专利技术所使用的样品的来源信息如下：哈维氏弧菌(VibrioharveyiCGMCC1.1599)、创伤弧菌(V.vulnificusATCC27562)、河流弧菌(V.fluvialisLMG7894)和铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaCGMCC1.1785)购买于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MarineCultureCollectionofChina,MCCC)，嗜水气单胞菌(AeromonashydrophilaCGMCC1.2017)、副溶血弧菌(VibrioparahaemolyticusCGMCC1.1997)、鳗利斯顿氏菌(ListonellaanguillarumATCC19264)和荧光假单胞菌(PseudomonasfluorescensCGMCC1.6279)购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter)，哈维氏弧菌(VibrioharveyiNBV269)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi10-S5)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi9-S29)有本实验室分离鉴定，健康大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)购买于宁波大学东校区附近水产市场。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述实施例1：引物、探针的设计及筛选根据GeneBank中已经公布的哈维氏弧菌toxR基因序列(AY247418),设计4对PCR扩增引物(表1)，经PCR扩增、测序获得哈维氏弧菌CGMCC1.1599toxR基因的编码序列，经Blast比对发现此序列只与哈维氏弧菌基因组有较高匹配。通过保守结构域搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)toxR基因的高度保守序列区域，根据RPA扩增技术引物设计原则,在toxR基因保守区域设计一条探针，在探针的两侧设计了3条上游和3条下游RPA引物(表1)用于筛选。上述所有引物、探针均有由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)合成。合成的引物采用如下的步骤进行筛选，并将筛选出的最好引物组合用于反应温度(37℃、38℃、39℃)和探针浓度(60nM、90nM、120nM、150nM)的优化。1)细菌基因组的提取将上述提到的五种弧菌划线接种于2216E固体培养基，37℃培养18h后，挑取单菌落于2216E液体培养基中，在37℃条件下于摇床中过夜培养至对数期生长期；将铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌划线接种于LB固体培养基，30℃培养18h后，挑取单菌落于LB液体培养基中，在30℃条件下于摇床中过夜培养至对数期生长期。取2ml各种新鲜菌液，按照细菌基因组提取试剂盒(Omega，美国)说明书步骤提取各种细菌基因组DNA，将DNA溶解于100μlddH2O中，-20℃保存备用。2)Real-timeRPA反应体系的构建及优化RPA的反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非疾病诊断治疗目的的检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)准备待检测菌的核酸样品提取待检测菌的基因组DNA作为扩增样品备用；2)构建Real‑time RPA反应体系体系将用于扩增哈维氏弧菌目的基因的正向引物和反向引物和RPA探针加入到重组酶聚合酶扩增体系中，再加入步骤1)制备的核酸样品；加入冻干酶粉，混匀后，转移到PCR管中，加入启动剂MgAc后进行荧光定量反应；采集荧光信号,判断是否形成扩增曲线，以扩增曲线存在与否判定是否存在哈维氏弧菌；所述的正向引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；反向引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述的RPA探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3：其中探针序列的第31位胸腺嘧啶T的标记物为FAM，第33位腺嘌呤A由四氢呋喃THF替换，第35位胸腺嘧啶T标记物为BHQ，3′端进行C3Spacer修饰。

【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断治疗目的的检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)准备待检测菌的核酸样品提取待检测菌的基因组DNA作为扩增样品备用；2)构建Real-timeRPA反应体系体系将用于扩增哈维氏弧菌目的基因的正向引物和反向引物和RPA探针加入到重组酶聚合酶扩增体系中，再加入步骤1)制备的核酸样品；加入冻干酶粉，混匀后，转移到PCR管中，加入启动剂MgAc后进行荧光定量反应；采集荧光信号,判断是否形成扩增曲线，以扩增曲线存在与否判定是否存在哈维氏弧菌；所述的正向引物，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；反向引物，其核苷酸序列为SEQIDNO:2；所述的RPA探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:3：其中探针序列的第31位胸腺嘧啶T的标记物为FAM，第33位腺嘌呤A由四氢呋喃THF替换，第35位胸腺嘧啶T标记物为BHQ，3′端进行C3Spa...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱鹏，庞建虎，严小军，高威芳，章礼平，朱竹君，张学恒，涂世盛，牟桐，罗杰，李艳荣，黄莉莉，胡岱福，任哲，
申请(专利权)人：宁波海洋研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33