一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种生物检测技术领域，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特点是，由根据抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列设计的特异性引物、捕获探针、检测探针，优化的NASBA扩增体系和优化的NASBA产物检测体系组成。能对玉米中抗草丁膦抗性基因成分进行简单快速的检测，具有高效的特异性和容易推广的优越性，也有助于转基因玉米中的抗草丁膦抗性基因成分bar的早期诊断；其检测方法是设计并人工合成抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列的特异性引物、捕获探针和检测探针，确定NASBA扩增反应程序和NASBA产物检测体系等步骤，检测方法避开了对特殊设备和专业人员的需求，结果灵敏度高且重复性好。

A rapid detection kit and detection method for maize resistance to phosphine resistant gene NASBA-ELISA

The invention relates to the field of biological detection technology, and is a rapid detection kit for NASBA_ELISA, a maize trans-glyphosate resistant gene component. The kit is characterized by optimized NASBA amplification system and optimized NASBA detection probe, which are designed by specific primers, capture probes and detection probes according to the mRNA sequence of the glyphosate resistant gene bar. Product detection system. It can be used to detect the glyphosate-resistant gene components in maize simply and quickly, and has high specificity and the advantages of easy popularization. It is also helpful for early diagnosis of the glyphosate-resistant gene bar in transgenic maize. Heterosexual primers, capture probes and detection probes were used to determine the NASBA amplification reaction procedure and NASBA product detection system. The detection method avoided the need for special equipment and professionals, and the results were highly sensitive and reproducible.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物检测
，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
随着转基因玉米的扩大种植，其安全性也受到国际社会和广大民众的广泛关注，世界各国都制订了相应安全性评价制度和转基因成分标识制度等，要求对转基因产品进行标识，转基因成分的检测也越来越受到重视。因此，急需一种快速检测方法满足玉米产品在种植及贸易中的监控需要。从吸水链霉菌中分离得到的bialaphosresistance(bar)基因被证明具有良好的抗草丁膦(PPT)除草剂效果，由于其非选择性、广谱、无残留的优点被广泛用于植物转基因的选择标记，bar基因也常被作为检测转基因的靶标元件。现有检测方法中，检测外源基因的表达产物常因加工过程中产品丧失抗原性导致无法检测。核酸法因其准确快速日益受关注，如聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)、实时荧光定量PCR和基因芯片等；但因需要昂贵的PCR仪及专业化的操作人员未能得到普及；基因芯片技术成本高、数据分析复杂。因此，找到一种简单快速高效的诊断方法势在必行。一种特异性等温扩增RNA的核酸序列依赖性扩增(nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)技术已有成功应用的报道，它是由一对特异性引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在41℃恒温下进行，可在2h内将模板RNA扩增约1012倍，且无需PCR仪等仪器，避免了PCR扩增结果重复性差的问题，也容易普及应用。本专利技术根据玉米转基因成分bar的mRNA基因序列设计了特异引物和探针，将高效的NASBA和简便的酶联检测法完美结合，研发出高效的NASBA检测转基因成分bar的快速检测试剂盒，短时间内对转基因成分bar进行高灵敏度筛查，灵敏度达到5fg，其操作简单、对设备要求低等优点适合在基层部门和采样现场普及应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，效果佳，应用价值高的玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，并提供其检测方法。本专利技术的目的是由以下技术方案来实现的：一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，它包括如下体系：1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的一对特异性引物bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScriptII反转录酶40U，核糖核酸酶H0.2U，20URNA酶抑制剂；2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的探针特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’，检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/LTris-HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；显色液：3mgpNPP于1mLddH2O，加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；终止液：0.5molNa2CO3溶液。一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测方法，它包含下述步骤：1)设计并人工合成玉米转基因成分bar的特异引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：(a)bar基因的一对特异性引物bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’；检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；2)NASBA扩增模板转基因玉米总RNA的制备液氮研磨120mg玉米叶片，加入1mLTrizol涡旋1min，室温放置15min；加500μL氯仿，颠倒混匀，室温放置5min，4℃，12000r/min离心15min；上清加入等体积异丙醇，冰浴20min，4℃，10000r/min离心10min，去上清；用75％乙醇洗涤沉淀两次，4℃，10000r/min离心5min，干燥后加50μLTE回溶；3)NASBA扩增反应体系及程序：(a)NASBA扩增反应液制备：20μL扩增反应液包2mmol/LdNTP，20mmol/LNTP，80mmol/LTris-HClpH8.5，20mmol/LMgCl2，240mmol/LKCl，10mmol/LDTT，200g/LDMSO，上、下游引物各0.4μmol/L；(b)酶反应液制备：5μL酶反应液包含40USupeScriptII反转录酶，80UT7RNA聚合酶，0.2U核糖核酸酶H和20URNA酶抑制剂；(c)扩增反应及程序采用20μL体系：10μL扩增反应液中加入0.5μL玉米总RNA和3.5μLddH2O，65℃加热2min去除RNA二级结构，41℃冷却2min，加入5μL酶反应液，41℃反应90min，冰浴2min终止反应后-20℃贮存，同时以无菌水做阴性对照；4)酶标板的制备：(a)酶标板包被液制备：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度；(b)酶标板封闭液制备：0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；(c)酶标板制备：96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板35次，4℃避光保存备用；5)NASBA扩增产物ELISA检测：(a)杂交反应：每孔中各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μLNASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，它包括如下体系：1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的一对特异性引物bar‑F：5’‑GATGCAAGGTCGCATATGAG‑GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG‑3’；bar‑R：5’‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG‑3’，下划线为T7启动子序列；(b)NASBA扩增缓冲液：Tris‑HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H 0.2U，20U RNA酶抑制剂；2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的探针特异性探针，即捕获探针：5’‑Biotin‑ATGCAAGGTCGCATATGAGT‑3’，检测探针：5’‑DIG‑AAGTCCAGCTGCCAGAAA‑3’；(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/LTris‑HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％Tween‑20；显色液：3mg pNPP于1mL ddH2O，加入1mL二乙醇胺，‑20℃避光保存；终止液：0.5mol Na2CO3溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，它包括如下体系：1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的一对特异性引物bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl2为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScriptII反转录酶40U，核糖核酸酶H0.2U，20URNA酶抑制剂；2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：(a)bar基因的探针特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’，检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/LTris-HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；显色液：3mgpNPP于1mLddH2O，加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；终止液：0.5molNa2CO3溶液。2.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测方法，其特征在于，它包含下述步骤：1)设计并人工合成玉米转基因成分bar的特异引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：(a)bar基因的一对特异性引物bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐亚维，董长颖，杨祥波，刘晓丹，张欣，王俊玲，尹锐，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22