一种冬荪液体菌种快繁方法技术

本发明专利技术公开了一种冬荪液体菌种快繁方法，该方法接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L。同时产生的冬荪液体菌种适宜作为工厂化发酵的液体种子，液体摇瓶培养参数能为冬荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。

A rapid propagation method of winter sun liquid strain

The invention discloses a method for rapid propagation of liquid strains of Dioscorea japonica, which has the advantages of simple preparation of inoculation point, rapid germination and two stages of liquid shaking; the second stage liquid strains shake the flask at the end of 5 days, in which Dioscorea japonica mycelium is of uniform size, large mycelium density and fresh mycelium weight can reach 27 g/L. The liquid strains produced at the same time are suitable for industrial fermentation of liquid seeds, liquid shaking flask culture parameters can lay a foundation for efficient and high-quality industrial production of winter sun sun sun fungus.

【技术实现步骤摘要】
一种冬荪液体菌种快繁方法
本专利技术涉及农业科技种子生产
，尤其是一种冬荪液体菌种快繁方法。
技术介绍
冬荪，又称竹下菌、男荪、无裙荪等，为担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、鬼笔属真菌，包含白鬼笔、香笔菌、重脉鬼笔三个生物种。冬荪为人工驯化的新食用菌，目前在贵州毕节市已有较大面积的人工栽培，林下腐殖质层中单生或群生，其出菇温度较低，子实体开伞在秋冬季节，因此当地菇农又称其为冬荪，分布于贵州、四川、云南、安徽、广东等地。冬荪是一种极佳的营养滋品，菌体洁白，久煮不糊，味道鲜美，口感松脆、细嫩、爽口，营养丰富。冬荪子实体中含有丰富的营养成分，有21种氨基酸，8种为人体所必须，约占氨基酸总量的1/3，其中谷氨酸含量尤其丰富，占氨基酸总量17%以上，为蔬菜与水果所不及，冬荪富含多种维生素和多种微量元素以及多糖等活动物质。同时冬荪菌柄可入药，药性为甘，淡，性温，有活血止痛，祛风除湿的功效。中世纪时，白鬼笔曾用于治疗痛风。因此，冬荪具有较高的营养和保健价值。冬荪人工栽培起源于贵州省大方县，在上世纪80年代，就有收山货的商贩收购野生白鬼笔销往四川、江浙一带。在上世纪90年代初期大方县就出现自行分离菌种栽培白鬼笔，但20多年来，冬荪制种还是停留在固体菌种生产工艺上，即从竹蛋分离母种—母种扩大—原种扩繁—栽培种生产。同时冬荪菌丝生长速度缓慢，木屑培养基中长满瓶（体积500ml）需要4个月之久。传统的冬荪固体母种到栽培种的生产过程一般要经过大半年的时间，菌种生产周期较长,培养成本较高，不易量产；且长时间培养瓶/袋口菌丝极易吐黄水，造成同批次栽培种的菌龄与活力常常参差不齐，严重影响了冬荪的产量与品质。目前冬荪驯化成功且大面积人工种植的3个品种中，白鬼笔、香笔菌、重脉鬼笔均未有液体菌种的相关研究报道。本专利采用的接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L；使冬荪菌种的工厂化生产与应用真正成为可能，解决了冬荪制种中速度慢与质量差的技术难题，具有很大菌种工厂化生产应用和推广价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种冬荪液体菌种快繁方法，实现5天结束液体摇瓶，产生的冬荪菌丝球大小均匀、菌丝球密度大，适宜于工厂化液体发酵。为冬荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。本专利技术是这样实现的，包含以下步骤：1）一级液体培养基制做：按葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、马铃薯100g/L（煮汁过滤）、酵母粉1.5g/L、VB10.01g/L、琼脂粉1.5g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）。2）冬荪一级液体菌种制备：75%酒精表面消毒长满平皿的红托竹荪母种，置于超净工作台中；无菌条件下用解剖刀划取蚕豆大小的母种5块转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后上摇床暗培养（23℃、180r/min）。接种点3天萌动，20天结束一级液体菌种的摇瓶培养。3）二级液体培养基制做：按葡萄糖25g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁2g/L、马铃薯280g/L（煮汁过滤）、酵母粉0.5g/L、VB10.03g/L、琼脂粉1.5g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）。4）冬荪二级液体菌种制备：75%酒精表面消毒一级液体菌种；无菌条件下用无菌的5ml枪头吸取匀质的一级液体菌种转入二级液体培养基中培养（接种量体积比为1：30），完成接种后上摇床暗培养（23℃、180r/min），5天能结束二级液体菌种的摇瓶培养。图1冬荪液体菌种。具体实施例。2017年8-10月，在贵州省农作物品种资源研究所真菌室进行冬荪的液体摇瓶培养，具体步骤如下：1）2017年8月底进行一级液体培养基制做：按葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、马铃薯100g/L（煮汁过滤）、酵母粉1.5g/L、VB10.01g/L、琼脂粉1.5g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）、冷却后备用。2）2017年9月初进行冬荪一级液体菌种制备：75%酒精表面消毒长满平皿的红托竹荪母种，置于超净工作台中；无菌条件下用解剖刀划取蚕豆大小的母种5块转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后上摇床暗培养（23℃、180r/min）。接种点3天萌动，20天结束一级液体菌种的摇瓶培养。3）2017年9月下旬进行二级液体培养基制做：按葡萄糖25g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁2g/L、马铃薯280g/L（煮汁过滤）、酵母粉0.5g/L、VB10.03g/L、琼脂粉1.5g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）、冷却后备用。4）2017年9月底进行冬荪二级液体菌种制备：75%酒精表面消毒一级液体菌种置于超净工作台灭菌；无菌条件下用无菌的5ml枪头吸取匀质的一级液体菌种转入二级液体培养基中培养（接种量体积比为1：30），完成传代后上摇床暗培养（23℃、180r/min），5天结束二级液体菌种的摇瓶培养。5）2017年10月初进行冬荪二级液体菌种的验证，包括菌种一致性鉴定、菌丝产量等。将发酵好的冬荪二级液体菌种接种到PDA培养基中、25℃暗培养，同时提取菌丝球的DNA进行cDNA-ITS的扩增与GenBank比对鉴定；另外抽滤二级液体菌种直至不再滴水后，测定菌丝产量。结果表明：二级液体菌种转接到PDA培养基中，3天后开始萌动、1个星期菌丝扭结成菌束，这符合冬荪25℃暗培养的特征；同时GenBank中的cDNA-ITS比对的鉴定也为冬荪的生物种；抽滤法得到冬荪二级液体菌种菌丝鲜重为27.6g/L。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冬荪液体菌种快繁方法，其特征在于：接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L。

【技术特征摘要】
1.一种冬荪液体菌种快繁方法，其特征在于：接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L。2.根据权利要求1所述的分两个阶段液体摇瓶是指，第一阶段摇瓶所得为一级液体菌种，利用一级液体菌种传代培养二级液体菌种。3.两个阶段培养参数均为23℃暗培养、180r/min，二级液体菌接种量1:30（体积比）。4.根据权利要求4所述的一级液体摇瓶的培养基参数具体是指，葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、马铃薯100g/L（煮汁过滤）、酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄万兵，朱国胜，桂阳，卢颖颖，张丽娜，龚光禄，杨通静，陈娅娅，郎柳录，
申请(专利权)人：贵州省农作物品种资源研究所，贵州利康农科技有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52