一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法技术

本发明专利技术公开了一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法。它包括制备初始接种液、建立流动池生物膜、进行土壤生物膜群落动态组成和多样性分析以及土壤生物膜中可培养细菌的分离鉴定等步骤。本发明专利技术建立了一个研究土壤生物膜多样性以及早期演替的模型，通过组建由土壤微生物组成的流动培养的生物膜，然后利用PCR技术和高通量测序分析，将微生物进行分类，并分离不同时期占主导地位的菌株，从而实现对土壤生物膜微生物群落演替的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法
本专利技术属于微生物领域，涉及一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法。
技术介绍
在土壤中，绝大多数微生物分布在土壤矿物、根际等固相表面，形成微菌落或生物膜。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种细胞聚集体，由细菌和自身分泌的胞外基质组成，是微生物面对复杂外界环境的一种重要的生存方式。生物膜细胞与游离细胞在很多方面是完全不同的，形成生物膜的细胞的基因表达与游离细胞的基因表达差异明显，生物膜中的细胞表达的模式比游离的细胞更加复杂，生物膜与游离细胞相比，细菌自身分泌胞外物质EPS能够保护细胞免受干旱、氧化作用、有毒化合物、重金属离子，抗生素，紫外线照射的侵害，以及原生动物的捕食。生物膜群落中产生的胞外酶能够降解胞外的营养物质，使之成为细胞可利用的能源物质。此外，EPS组分能够固定细胞，使细胞紧密结合，细胞之间产生强烈的相互作用，如：细胞与细胞之间的交流合作。在多物种生物膜中，种间相互作用显著影响细菌的分布以及生物量的产生，给人们的生活带来各种影响。例如：一方面多物种生物膜内微生物之间相互作用可提高病原菌的抗性或者毒力从而引起人类疾病，对人类的健康造成威胁；另一方面，生物膜中的竞争和合作也能发挥积极作用，如降解有机污染物、提供生物屏障等，从而影响生物膜整体功能及周围环境，这对于人类的健康和活动有着重要影响。如何认识生物膜以及如何趋利避害使生物膜造福于人类已成为当今世界的重要课题。目前，大多数有关生物膜的研究都是采用的简化法，即单一物种生物膜。然而，在土壤中几乎所有的生物膜都包含有多个物种，不同物种间的相互作用对生物膜的形成和结构功能的影响不同。土壤中微生物群体具有高度的多样性，据估计1g森林土壤有105-106种不同的微生物，总量达到109个。形成土壤生物膜的不仅只有细菌，还有酵母、真菌、藻类、原生动物等，导致土壤生物膜这个集合体在分类、功能水平上的多样化。演替是研究生态学的一项重要内容，它是一种特定环境中某个生境的生物学变化过程，其中植物和动物生态系统中演替被广泛研究，但是微生物在自然界中分布广泛，却鲜有研究微生物的演替过程。这是由于利用传统的依赖实验室培养微生物的方法的局限性导致研究微生物的演替很困难。然而，随着分子生物学的发展，能够快速调查研究微生物群落的结构和组成，为研究微生物群落水平的演替过程和竞争动力学模型提供了绝佳的机会。
技术实现思路
本专利技术的目的是鉴于目前鲜有对土壤生物膜的形成过程、群落结构的变化趋势等进行的研究，从建立土壤生物膜模型入手，借助现代的分子生物学技术，研究土壤生物膜的早期演替过程和种间互作，从而为人类的健康和活动带来积极作用。本专利技术的具体技术方案如下：一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法，它包括以下步骤：(1)制备初始接种液：将过筛土样与无菌去离子水混合，50-150rpm振荡过夜，使得土壤中的细菌溶到水中，然后将琼脂涂到灭菌的玻片表面，直到琼脂表面变硬，将涂满琼脂的玻片放到土样中，让玻片接触到液相层又不干扰固相层，25-30℃、10-50rpm摇床振荡3-10天，使得细菌充分与玻片表面接触，最后取出玻片，将琼脂刮取下来并加入PBS溶液吹打混匀，作为流动生物膜的初始接种液；(2)建立流动池生物膜：将涂有琼脂的玻片平铺在流动槽中，将上述得到的初始接种液接种到流动槽中，超净台室温静置1-6h，然后向流动槽中通入灭菌的土壤浸提液并以5-10mL/min的流速循环回流，控制流动槽内的温度为20-30℃，使细菌在玻片上形成生物膜，最后间隔取样，每次取两块玻片，一块用于分析土壤生物膜群落动态组成和多样性，另一块用来分离鉴定土壤生物膜中可培养的细菌；(3)土壤生物膜群落动态组成和多样性分析：将形成生物膜的玻片用土壤DNA提取试剂盒提取总DNA，设计通用引物进行PCR扩增，切胶回收PCR产物，进行高通量测序，根据测序结果对不同时期的土壤生物膜群落动态组成和多样性进行分析；(4)土壤生物膜中可培养细菌的分离鉴定：从形成生物膜的玻片上刮取琼脂并加入生理盐水，振荡、离心，取上清，逐级梯度稀释涂平板，37℃培养3-7天，随机挑取单菌落，分离纯化并扩大培养，试剂盒提取总DNA，设计通用引物进行PCR扩增，切胶回收PCR产物、纯化后进行测序分析，绘制可培养菌株发育树。步骤(3)中的通用引物是：正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’反向引物：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。步骤(4)中的通用引物是：正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物：5’-GGTTACCTTGTTAGGACTT-3’。本专利技术的有益效果是：由于土壤环境的复杂性、微生物之间复杂的种间互作关系，导致人们目前对土壤中生物膜的组成与功能所知甚少，并且实验室条件能够在培养基上培养的微生物不超过所有微生物总和的1％，这使得土壤生物膜的评估更为困难。本专利技术建立了一个研究土壤生物膜多样性以及早期演替的模型，通过组建由土壤微生物组成的流动培养的生物膜，然后利用PCR技术和高通量测序分析，将微生物进行分类，并分离不同时期占主导地位的菌株，从而实现对土壤生物膜微生物群落演替的研究。一般认为实验室建立的生物膜模型不等同于实际土壤中的生物膜，在长期的实验过程中，生物膜都是暴露在连续低营养的水环境中的，而实际土壤中的有机质是能够通过外界源源不断得到补充的，这会影响生物膜的演替过程。而我们建立的土壤流动生物膜模型，尽量还原了土壤中微生物群落从游离、富集，然后形成生物膜的全过程。使用生物膜初始接种液的原因是确保流动生物膜的建立与土壤真实环境在同一个起点，初始接种液是由7天的生物膜群体组成，一般认为这个时间段是建立生物膜的最好时期。利用本专利技术得到的研究结果表明：当微生物定殖到一个新的表面上时，微生物丰度会增加，而随着竞争作用的增强，物种丰度降低，到了演替末期资源多样性增加导致另外一种细菌的丰度增加，并且在生物膜中建立新的空间位点和生态位，同时发现微生物群落的聚集是根据群落的年龄而定。本研究中两种生物膜一开始都是芽孢菌属占据主导地位，随着竞争作用的增强，其它菌属的丰度逐渐增加，而削弱了芽孢菌属的主导地位。本研究得到的33株菌全部都是革兰氏阴性菌，并且以变形菌门为主，这说明在生物膜形成的早期以革兰氏阴性菌占主导地位，这一结果在很多文献中也有相似的报道。由主成分分析可知，在两种生物膜演替过程中，第一天物种差异不明显，随后差异逐渐加大。因此可得出以下结论：两种生物膜中的微生物群落具有较高的相似性，就总体而言，土壤生物膜以芽孢菌纲、γ-变形菌纲、β-变形菌纲、α-变形菌纲、梭菌纲以及Flavobacteriia纲占主导地位，其中芽孢菌纲在两种生物膜中占绝对优势，随着时间的变化，这几种优势菌发生演替变化，其中高产田土壤生物膜中的芽孢菌纲的绝对优势地位逐渐被β-变形菌纲所取代，而低产田土壤生物膜中的芽孢菌纲的绝对优势地位最终被γ-变形菌纲、β-变形菌纲削弱。附图说明图1不同时期高低产土壤生物膜中细菌群落的聚类分析示意图。图2高产土壤样品生物膜中优势菌随时间变化的试验结果。图3低产土壤样品生物膜中优势菌随时间变化的试验结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备初始接种液：将过筛土样与无菌去离子水混合，50‑150rpm振荡过夜，使得土壤中的细菌溶到水中，然后将琼脂涂到灭菌的玻片表面，直到琼脂表面变硬，将涂满琼脂的玻片放到土样中，让玻片接触到液相层又不干扰固相层，25‑30℃、10‑50rpm摇床振荡3‑10天，使得细菌充分与玻片表面接触，最后取出玻片，将琼脂刮取下来并加入PBS溶液吹打混匀，作为流动生物膜的初始接种液；(2)建立流动池生物膜：将涂有琼脂的玻片平铺在流动槽中，将上述得到的初始接种液接种到流动槽中，超净台室温静置1‑6h，然后向流动槽中通入灭菌的土壤浸提液并以5‑10mL/min的流速循环回流，控制流动槽内的温度为20‑30℃，使细菌在玻片上形成生物膜，最后间隔取样，每次取两块玻片，一块用于分析土壤生物膜群落动态组成和多样性，另一块用来分离鉴定土壤生物膜中可培养的细菌；(3)土壤生物膜群落动态组成和多样性分析：将形成生物膜的玻片用土壤DNA提取试剂盒提取总DNA，设计通用引物进行PCR扩增，切胶回收PCR产物，进行高通量测序，根据测序结果对不同时期的土壤生物膜群落动态组成和多样性进行分析；(4)土壤生物膜中可培养细菌的分离鉴定：从形成生物膜的玻片上刮取琼脂并加入生理盐水，振荡、离心，取上清，逐级梯度稀释涂平板，37℃培养3‑7天，随机挑取单菌落，分离纯化并扩大培养，试剂盒提取总DNA，设计通用引物进行PCR扩增，切胶回收PCR产物、纯化后进行测序分析，绘制可培养菌株发育树。...

【技术特征摘要】
1.一种分析土壤生物膜微生物群落演替的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备初始接种液：将过筛土样与无菌去离子水混合，50-150rpm振荡过夜，使得土壤中的细菌溶到水中，然后将琼脂涂到灭菌的玻片表面，直到琼脂表面变硬，将涂满琼脂的玻片放到土样中，让玻片接触到液相层又不干扰固相层，25-30℃、10-50rpm摇床振荡3-10天，使得细菌充分与玻片表面接触，最后取出玻片，将琼脂刮取下来并加入PBS溶液吹打混匀，作为流动生物膜的初始接种液；(2)建立流动池生物膜：将涂有琼脂的玻片平铺在流动槽中，将上述得到的初始接种液接种到流动槽中，超净台室温静置1-6h，然后向流动槽中通入灭菌的土壤浸提液并以5-10mL/min的流速循环回流，控制流动槽内的温度为20-30℃，使细菌在玻片上形成生物膜，最后间隔取样，每次取两块玻片，一块用于分析土壤生物膜群落动态组成和多样性，另一块用来分离鉴定土壤生物膜中可培养的细菌；(3)土壤生物膜群落动态组成和多样性分析：将形成生物膜的玻片用土壤DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡鹏，高春辉，曹慧，吴一超，黄巧云，李准洁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42