一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法技术方案

本发明专利技术公开一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法。本发明专利技术在4‑MBA标记的金纳米颗粒表面包裹一层聚多巴胺，形成金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记，利用金银纳米粒子间的缝隙具有独特的局域表面等离子体共振极大的放大SERS标记的拉曼信号；同时，本发明专利技术利用酶切循反应结合磁性捕获机制进一步放大SERS信号，实现对miRNA快速的高灵敏定量检测。本发明专利技术操作简单，检测稳定性好，检测灵敏度高；操作时只需将酶切循环反应后的孵育液依次加入到功能化磁性纳米颗粒中反应，再与SERS标记反应，反应结束后通过磁分离可马上进行检测，从而实现快速定量检测；可应用于早期癌症的临床诊断筛查。

A super sensitive detection method of miRNA based on dual amplification SERS signal system

The invention discloses a method for ultrasensitive detection of miRNA based on dual amplifying SERS signal system. The invention wraps a layer of polydopamine on the surface of 4 MBA-labeled gold nanoparticles to form a SERS tag of gold PDA silver satellite structure, amplifies the Raman signal of SERS tag by using the gap between gold and silver nanoparticles with unique local surface plasmon resonance, and combines the enzyme digestion-following reaction with magnetic field. The sex acquisition mechanism further amplifies the SERS signal and realizes the rapid and highly sensitive quantitative detection of miRNA. The invention has the advantages of simple operation, good detection stability and high detection sensitivity, and can be used for rapid quantitative detection by adding the incubation liquid after enzyme digestion and cycling reaction into the functional magnetic nanoparticles in turn and then reacting with SERS marker. Clinical screening for cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA(microRNA)的方法。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是两类非编码(Non-coding)RNA中的短链RNA，一般大小约为22～24个碱基，广泛参与细胞的生长、增殖和分化，影响着人体的生理和病理活动，并且与肿瘤的发生、发展有着密切关系，是目前研究的热点。目前检测miRNA的方法主要有量子点、荧光法和qt-PCR等，但这些方法由于其本身特性存在一定局限性，比如毒性、易光漂白、操作复杂等，无法达到现代医学要求的衡量检测等。而由于miRNA的短序列和在人体内的低表达等原因在临床中很难检测，因此建立快速、简单、无毒、超灵敏度检测miRNA的方法具有非常重要的意义。拉曼光谱技术可以从分子水平检测物质分子的振动光谱来识别和区分不同物质，但由于拉曼散射较弱，普通的拉曼光谱技术在分析痕量物质时灵敏度存在不足。表面增强拉曼散射(surfaceenhancedRamanscattering，SERS)技术是一种新颖的光谱标记方法，利用金属表面显著增强的电磁场放大分子拉曼信号，可以用于生化痕量分析。SERS在生化检测中应用主要分为两大类：直接检测法和间接检测法(SERS标记技术)。直接检测法主要是测得待测物质本身的拉曼振动，但由于生物分子本身的拉曼散射截面较小，直接检测时信号较弱，且在复杂生物体系所得拉曼信号十分复杂，不利于生化分析。SERS标记作为一种新颖的光谱标记方法，利用金银等贵金属纳米粒子增强其表面的标记分子的拉曼信号，并将其特征峰作为检测信号，利用SERS信号探针特异性检测生物分子。与其他光谱分析方法相比，SERS具有独特的优势：(1)拉曼标记分子谱峰窄，分辨率高，可以用于多组分检测；(2)水的拉曼信号极其微弱，SERS可以广泛应用于水溶剂体系(生物体系)的检测；(3)SERS信号几乎不受光漂白影响，不容易发生光猝灭；由于SERS独特的优点，SERS纳米探针在生化分析和医学研究中有良好的应用前景，使其成为自然科学研究中的热点。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法。该方法是采用局域表面等离子共振的SERS信号放大双金属基底集合酶切循环放大反应实现对microRNA的超灵敏检测。通过双金属信号增强和酶切循环系统放大信号，实现信号双重放大，实现对样品中的miRNA进行快速、高灵敏度的定量分析，解决现有技术对miRNA检测灵敏度不够、耗时过长等问题。本专利技术的方法具有灵敏度高、普适性、检测过程简单、准确定量检测等特点。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，包括如下步骤：(1)选用4-MBA作为拉曼信号分子，通过该分子一端-SH与金纳米颗粒结合，反应完全加入多巴胺(DA)溶液，通过多巴胺氧化自聚合反应在金纳米颗粒表面形成聚多巴胺(PDA)壳层；(2)将步骤(1)中包裹后的SERS标记金纳米颗粒用等体积银氨溶液混合，通过PDA表面丰富的儿茶酚基团和氨基基团原位吸附银离子并原位还原为银纳米颗粒，得到金-PDA-银卫星结构的SERS标记；(3)将特异性识别miRNA的发卡结构适配体和不同浓度的miRNA标准样品液混合反应，miRNA特异性打开发卡结构适配体，裸露出与桥接DNA互补的碱基序列Ⅲ；加入桥接DNA，使碱基序列Ⅲ与桥接DNA形成杂交DNA双链后，再加入剪切酶，剪切酶特异性识别双链的特定位点，剪切桥接DNA成为两段，从发卡结构适配体中游离出来；剪切完毕后发卡结构适配体的碱基序列Ⅲ区域又裸露出来，可以再与体系中桥接DNA互补配对，剪切反应循环，体系中切断的桥接DNA在循环反应中随miRNA的增加而增加；酶切循环放大反应完毕，加热使酶失活；(4)将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基，加入与桥接DNA的3′端互补配对的-NH2适配体AptamerS1，反应完成用Tris-Ac(三羟甲基氨基甲烷-醋酸)清洗3遍，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；(5)将步骤(3)中酶切循环反应的溶液加入步骤(4)中的适配体功能化磁性纳米颗粒中孵育，通过碱基互补配对形成捕获探针；(6)将步骤(5)中的捕获探针与步骤(2)的金-PDA-银卫星结构的SERS标记混合，随着步骤(3)中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体AptamerS1，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体AptamerS1互补配对后，桥接DNA仍存在部分裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π-π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；(7)根据miRNA浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对miRNA进行定量检测。在上述检测miRNA的方法中：所述的miRNA为人microRNA-31；其序列为：5′-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3′。步骤(1)中所述的4-MBA是4-巯基苯甲酸；步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径优选为70nm～85nm；优选为80nm；步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5～1.5mmol/L；优选为1mmol/L。步骤(2)中所述的银氨溶液为新制银氨溶液，浓度为1～20mmol/L；优选为6～18mmol/L；更优选为12mmol/L；步骤(3)中所述的发卡结构适配体序列为：5′-AGCTATGCCAGCATCTTGCCTGCAAAAAAAATCCTCAGCAGGACCG-3′；步骤(3)中所述的桥接DNA序列为：5′-GCAAACAACTGCTGAGGATAAACG-3′；步骤(3)中所述的发卡结构适配体浓度优选为0.5～1.5μmol/L；更优选为1μmol/L。步骤(3)中所述的桥接DNA的浓度优选为0.5～1.5μmol/L；更优选为1μmol/L。步骤(3)中所述的一组具有浓度梯度的标准样品液为0mol、0.2fM、0.4fM、0.6fM、0.8fM、1.0fM、1.2fM、1.4fM、1.6fM、1.8fM、2.0fM、2.2fM、3fM、5fM以及10fM，其中0mol为空白对照；步骤(3)中所述的发卡结构适配体与miRNA标准样品液的体积比值为6～10；优选为10。步骤(3)中所述的剪切酶优选为Nb.BbvCI切刻内切酶。步骤(4)中所述的适配体AptamerS1序列为：5′-GCAGTTGTTTGCTTTTTTTTTT-(CH2)7-NH2-3′；步骤(4)中所述的适配体AptamerS1的浓度优选为0.5～1.5μmol/L；更优选为1μmol/L。步骤(4)所述的活化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；步骤(4)中所述的表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe3O4，其粒径优选为200～300nm；步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)选用4‑MBA作为拉曼信号分子，通过该分子一端‑SH与金纳米颗粒结合，反应完全加入DA溶液，通过多巴胺氧化自聚合反应在金纳米颗粒表面形成PDA壳层；(2)将步骤(1)中包裹后的SERS标记金纳米颗粒用等体积银氨溶液混合，通过PDA表面丰富的儿茶酚基团和氨基基团原位吸附银离子并原位还原为银纳米颗粒，得到金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记；(3)将特异性识别miRNA的发卡结构适配体和不同浓度的miRNA标准样品液混合反应，miRNA特异性打开发卡结构适配体，裸露出与桥接DNA互补的碱基序列Ⅲ；加入桥接DNA，使碱基序列Ⅲ与桥接DNA形成杂交DNA双链后，再加入剪切酶，剪切酶特异性识别双链的特定位点，剪切桥接DNA成为两段，从发卡结构适配体中游离出来；剪切完毕后发卡结构适配体的碱基序列Ⅲ区域又裸露出来，再与体系中桥接DNA互补配对，剪切反应循环，体系中切断的桥接DNA在循环反应中随miRNA的增加而增加；酶切循环放大反应完毕，加热使酶失活；(4)将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基，加入与桥接DNA的3′端互补配对的‑NH2适配体Aptamer S1，反应完成用Tris‑Ac清洗3遍，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；(5)将步骤(3)中酶切循环反应的溶液加入步骤(4)中的适配体功能化磁性纳米颗粒中孵育，通过碱基互补配对形成捕获探针；(6)将步骤(5)中的捕获探针与步骤(2)的金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记混合，随着步骤(3)中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体Aptamer S1，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体Aptamer S1互补配对后，桥接DNA上仍存在部分裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π‑π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；(7)根据miRNA浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对miRNA进行定量检测。...

【技术特征摘要】
1.一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)选用4-MBA作为拉曼信号分子，通过该分子一端-SH与金纳米颗粒结合，反应完全加入DA溶液，通过多巴胺氧化自聚合反应在金纳米颗粒表面形成PDA壳层；(2)将步骤(1)中包裹后的SERS标记金纳米颗粒用等体积银氨溶液混合，通过PDA表面丰富的儿茶酚基团和氨基基团原位吸附银离子并原位还原为银纳米颗粒，得到金-PDA-银卫星结构的SERS标记；(3)将特异性识别miRNA的发卡结构适配体和不同浓度的miRNA标准样品液混合反应，miRNA特异性打开发卡结构适配体，裸露出与桥接DNA互补的碱基序列Ⅲ；加入桥接DNA，使碱基序列Ⅲ与桥接DNA形成杂交DNA双链后，再加入剪切酶，剪切酶特异性识别双链的特定位点，剪切桥接DNA成为两段，从发卡结构适配体中游离出来；剪切完毕后发卡结构适配体的碱基序列Ⅲ区域又裸露出来，再与体系中桥接DNA互补配对，剪切反应循环，体系中切断的桥接DNA在循环反应中随miRNA的增加而增加；酶切循环放大反应完毕，加热使酶失活；(4)将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基，加入与桥接DNA的3′端互补配对的-NH2适配体AptamerS1，反应完成用Tris-Ac清洗3遍，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；(5)将步骤(3)中酶切循环反应的溶液加入步骤(4)中的适配体功能化磁性纳米颗粒中孵育，通过碱基互补配对形成捕获探针；(6)将步骤(5)中的捕获探针与步骤(2)的金-PDA-银卫星结构的SERS标记混合，随着步骤(3)中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体AptamerS1，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体AptamerS1互补配对后，桥接DNA上仍存在部分裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π-π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；(7)根据miRNA浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对miRNA进行定量检测。2.根据权利要求1所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：所述的miRNA为人microRNA-31；其序列为：5′-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3′。3.根据权利要求1所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径为70nm～85nm；步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5～1.5mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇军，江宁静，朱挺锋，余萌，张文建，王棋，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44