一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及畜禽发病模型构建技术领域，尤其涉及一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法。该鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法以新开产的SPF母鸡为试验动物，从感染前2天开始整个试验期控制环境温度在10‑15℃，采用H9亚型AIV与禽源大肠杆菌强毒株、IBV M41株通过滴鼻方式依次联合感染，感染鸡表现出明显的发热、精神萎靡、咳喘症状，剖检病鸡具有H9亚型禽流感的特征病变，模型稳定可靠。该鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法，获得的发病模型稳定、典型，为后续开展禽流感药物防治研究奠定了重要的基础。

Construction method of a chicken H9 subtype avian influenza artificial infection model

The invention relates to the technical field of constructing animal disease model, in particular to a method for constructing an artificial infection model of chicken H9 subtype avian influenza. The artificial infection model of H9 subtype avian influenza in chickens was established. The experimental animals were SPF hens. The temperature of the environment was controlled at 10 15 from 2 days before infection. The infected chickens were infected by H9 subtype AIV, avian Escherichia coli and IBV M41 strains by nose dropping. The infected chickens showed obvious hair. Fever, depression, cough and asthma symptoms, dissection of sick chickens with H9 subtype of avian influenza characteristics of pathological changes, stable and reliable model. The method of constructing artificial infection model of H9 subtype avian influenza in chicken was stable and typical, which laid an important foundation for the follow-up study of avian influenza drug control.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法
：本专利技术涉及畜禽发病模型构建
，尤其涉及一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法。
技术介绍
：禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)感染引起的严重危害养禽业的一种急性接触性传染病，给养禽业带来了巨大的经济损失。生物安全和免疫接种是目前主要的防控手段。但由于AIV易于变异、亚型众多、各亚型间交叉免疫保护力弱，导致免疫失败的现象屡屡发生，为该病的免疫预防带来了困难。研制防治禽流感的有效药物，对控制禽流感具有重要的作用。在新兽药的研发中，成功构建出理想的发病模型，对科学评价新兽药的临床疗效具有至关重要的作用。在以往的研究中，禽流感发病模型的构建存在以下困难：采用低致病性的H9亚型AIV对SPF鸡攻毒时，发病症状非常轻微，临床上表现不出明显的症状；采用高致病性H5亚型AIV攻毒时，由于毒力过强，发病鸡几乎100％死亡，而且H5亚型高致病性禽流感临床试验国家严格管控。以上两种情况，均不利于对禽流感防治药物的药效做出正确评价，严重制约了禽流感防治药物的研发。因此，构建出一种发病症状明显、病鸡死亡率适宜的禽流感发病模型，对加快禽流感的药物防治研究具有重要意义。
技术实现思路
：本专利技术提供了一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法，解决了现有技术中存在的问题。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法，以新开产的SPF母鸡为试验动物，从感染前2天开始整个试验期控制环境温度在10-15℃，采用H9亚型AIV与禽源大肠杆菌强毒株、IBVM41株通过滴鼻方式依次联合感染，各病原菌剂量均为0.3-0.5mL/只，感染鸡表现出明显的发热、精神萎靡、咳喘症状，剖检病鸡具有H9亚型禽流感的特征病变，即得鸡H9亚型禽流感人工感染模型。所述新开产的SPF母鸡为130-150日龄。所述联合感染为试验动物先用H9亚型禽流感病毒原液滴鼻0.5mL，间隔25-35min，再用禽源大肠杆菌c84008株新鲜培养液滴鼻0.5mL，最后间隔25-35min，用IBVM41病毒原液滴鼻0.5mL。本专利技术的有益效果：本专利技术构建方法克服了单独感染H9亚型AIV时，感染鸡发病症状极其轻微、不利于药物临床疗效试验评价的问题。通过选择了新开产的SPF母鸡，与其它日龄鸡相比，更易发病，卵巢、输卵管病变具有特征性，易于对发病做出正确诊断；在感染时将环境控制在10-15℃这一较低温度，给感染鸡充分、有效的冷应激，与正常饲养温度时对比，由于机体抵抗力下降，感染鸡更易发病，咳、喘症状更加严重；通过采用H9亚型禽流感病毒、大肠杆菌、鸡传染性支气管炎病毒依次混合感染，在加重病情的基础上，使临床症状更加明显，且出现了适宜比例的死亡率。本专利技术构建的H9亚型禽流感人工感染发病模型具有发病症状明显、病变典型、发病率高、死亡率适宜、稳定可靠的特点，为开展禽流感药物防治研究奠定了重要的基础。附图说明：图1为本专利技术构建方法获得的发病模型第四天时PCR检测结果；图中，M为DL2000DNAMarker；1，2，3，4，5，6，7为样品。具体实施方式：为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本专利技术进行详细阐述。实施例11、材料与方法1.1、毒株：H9亚型AIV株，EID50为EID50＝10-6.83/0.1mL；IBVM41株，EID50为1.0×10-6.5/0.1mL；禽源大肠杆菌c84008株。1.2、试验动物：130日龄SPF青年蛋鸡1.3、试验方法(1)攻毒：2017年11月16日，130日龄SPF青年蛋鸡8只，饲养于SPF鸡饲养隔离器中，从感染前2天开始，饲养温度设定为15℃，每只鸡先滴鼻H9AIV原液0.5mL，所有鸡滴完后，再滴IBVM41株原液0.5mL，滴完后再每只鸡滴鼻大肠杆菌c84008株新鲜肉汤培养物0.5mL；各原液间隔感染事件为30min；(2)临床症状及病理变化观察：攻毒后，每天观察鸡群临床症状及死亡情况，并做好记录；(3)称重：试验开始和结束时，每只鸡称重，计算增重率；(4)体温测定：攻毒后24h开始，每天用体温计测量体温；(5)抗体测定：试验开始前和结束时，每只鸡采血，测定H9AIV抗体水平；(6)排毒测定：攻毒后24h开始，用棉拭子每只鸡泄殖腔采集样本，将采样后的棉拭子放入2mL离心管中，加入500μL生理盐水，在旋涡混合器上振荡1min，置冷冻离心机10000r/min离心5-10min，取上清200μL，TRIZol法提取RNA；再用RT-PCR法检测H9亚型AIV；根据公开发表的H9N2禽流感病毒全基因组序列，设计HA基因的扩增引物，其中上游引物P1：5'-TCAATCAACAAACTCCACAGA-3'，下游引物P2：5'-CCACATGAAAAGAATGTTCT-3'，片段大小490bp；RT-PCR按一步法进行，采用20μL反应体系：2×onestepMix，10μL；OnestepEnzymemix，1μL；引物P1(10μM)，0.5μL；引物P2(10μM)，0.5μL；模板RNA，3μL；RnasefreeddH2O加至20μL。反应程序：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸30s，进行30个循环；72℃终延伸5min；RT-PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测。2、结果与分析2.1、临床症状及病理变化鸡攻毒48h以前，鸡群无任何异常；48h以后，出现明显的临床症状，禽流感症状典型，病鸡出现“呼噜呼噜”的湿性啰音，有的鸡出现尖叫声，许多鸡缩头，乍毛，精神不振；攻毒后第3天死亡1只。病鸡剖检：最典型的变化，卵泡充血、出血、坏死、液化，输卵管内有大量脓性或干酪样分泌物，腺胃乳头或乳头间有轻微出血，盲肠扁桃体肿胀出血，个别鸡心脏出血，气管轻微充血。2.2、体重变化攻毒后第10天与攻毒前相比，体重明显下降。表1攻毒鸡群体重变化结果初始平均体重(g)最终平均体重(g)增重(g)增重率(％)1196.51112.75-83.75-7.02.3、体温情况试验鸡攻毒前测定正常体温为41.2℃，攻毒后均出现了发热症状，攻毒后不同日期体温测定结果见表2。表2攻毒后不同日期鸡群平均体温测定结果2.4、抗体测定结果试验前，HI抗体滴度均为0；攻毒后第11天，试验结束时每只鸡采血，测定H9AIV抗体水平，HI抗体平均滴度为7.5。2.5、排毒测定结果攻毒后从第2天至6天，均可从泄殖腔拭子中检测到目的条带，尤其是3-5天时阳性率最高，表明攻毒后试验鸡具有排毒现象；攻毒后不同天数，鸡群H9AIV阳性率情况见表3，第4天时PCR检测结果见图1。表3攻毒后各天泄殖腔拭子H9AIVRT-PCR检测结果攻毒后天数1d2d3d4d5d6d7d8d阳性率(％)012.587.557.157.114.3003、结论从临床症状、剖检变化、体重、发热、HI抗体阳性、泄殖腔排毒阳性结果可以确认，本试验成功构建出了H9亚型禽流感发病模型。本试验所建立的H9亚型禽流感人工感染发病模型具有发病症状明显、病理变化具有特征性的特点，为开展H9亚型禽流感的药物防治研究奠定了重要的基础。实施例21、材料与方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法，其特征在于：以新开产的SPF母鸡为试验动物，从感染前2天开始整个试验期控制环境温度在10‑15℃，采用H9亚型AIV与禽源大肠杆菌强毒株、IBV M41株通过滴鼻方式依次联合感染，各病原菌剂量均为0.3‑0.5mL/只，感染鸡表现出明显的发热、精神萎靡、咳喘症状，剖检病鸡具有H9亚型禽流感的特征病变，即得鸡H9亚型禽流感人工感染模型。

【技术特征摘要】
1.一种鸡H9亚型禽流感人工感染模型的构建方法，其特征在于：以新开产的SPF母鸡为试验动物，从感染前2天开始整个试验期控制环境温度在10-15℃，采用H9亚型AIV与禽源大肠杆菌强毒株、IBVM41株通过滴鼻方式依次联合感染，各病原菌剂量均为0.3-0.5mL/只，感染鸡表现出明显的发热、精神萎靡、咳喘症状，剖检病鸡具有H9亚型禽流感的特征病变，即得鸡H9亚型禽流感人工感染模型。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵增成，林树乾，李桂明，宋敏训，黄中利，杨世发，傅剑，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37