本发明专利技术公开了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株与应用，表达菌株的制备方法为：将脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述脂肪酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，挑选阳性克隆，获得重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。将表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组解脂耶氏酵母脂肪酶，16小时培养后的活力达到为109.3U/mL。实现了饲料用脂肪酶的安全、稳定生产，在食品、能源、化工和医药等行业具有重要应用价值。
Recombinant lipase lipase and its expression strain and Application
The invention discloses a recombinant Yersinia lipolytica lipase and its expression strain and application. The expression strain is prepared by connecting the lipase gene to an expression vector to obtain a recombinant plasmid; the lipase gene has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO:1; and the recombinant plasmid is transformed into Bacillus subtilis. The positive clones were selected to obtain the recombinant lipase expressing strain of lipase. The recombinant Yersinia lipolytic yeast lipase was prepared by liquid fermentation with the expressed strain as the fermentation strain. The activity reached 109.3 U/mL after 16 hours culture. It realizes the safe and stable production of feed lipase and has important application value in food, energy, chemical and pharmaceutical industries.
【技术实现步骤摘要】
一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株与应用
本专利技术属于生物技术与饲料行业领域，具体涉及一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株与应用。
技术介绍
脂肪酶(lipase)是一类典型的羧酸水解酶，因能催化水解、酯化、转酯化等多种反应类型而广泛应用于食品、医药、能源、环境等领域，但脂肪酶在饲料方面的应用开发相对其它饲用酶仍处于起步阶段。以解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2为代表的饲用脂肪酶具有耐受肠胃环境、生物安全性好、pH及温度性能优越等诸多饲用酶所需特点，具有很高的开发应用潜力。饲用脂肪酶通过酶促生化反应，强化饲养动物的脂肪消化利用过程，在确保消化道酸性环境品质稳定的前提下，改善饲料中油脂消化吸收的限速步骤，解决高能营养物油脂的消化利用效率。其具体作用体现于：(1)外源性脂肪酶的添加有利于补充幼畜因消化机能发育不全所造成的内源性消化酶活性和分泌量的不足。成年动物的消化系统则因油脂消化利用更加有效而获得减负；(2)通过生态地改善动物的消化吸收环境，既能提高饲养动物肉类品质，也能有效降低因油脂消化利用问题诱发多种疾病的发生概率。例如：添加脂肪酶可以减少动物因高脂肪消化不良而造成的营养性腹泻，促进动物生长；(3)脂肪酶的加入可以减少油脂的添加量，节省配方空间，降低饲料成本；(4)脂肪酶添加使饲料原料的能量利用率最大化，减少集约化养殖中营养物质的排泄，对打造绿色生态养殖业具有重要意义。枯草芽孢杆菌是需氧，易于培养，生长周期较短，广泛存在于自然界中，无细胞毒性，易于分离纯化，转录翻译十分严格，不易产生错误，微生物研究中较为理想的模式菌株。枯草芽孢杆菌具有安全、无致病性等特性，被美国食品监督委员会成为GRAS(GenerallyRecognizedasSafe)，又是益生菌。其次枯草芽孢菌细胞膜为单层，分泌的蛋白容易回收、纯化。，操作简单，并且能够产生多种酶类分泌到细胞外；此外，枯草芽孢杆菌易于培养，对培养基成分要求不严格，克采用相对低廉培养基成分，有效的降低生产成本，质粒、噬菌体都可作为克隆载体，没有明显的密码子偏好性，转录翻译系统十分严密，可以避免错误折叠的蛋白质和包涵体，因而在发酵领域有较好的应用前景。现有的技术可利用生物载体进行脂肪酶的生产，如闫金勇等利用毕赤酵母表达生产脂肪酶，如徐莉等利用转化解脂耶氏酵母生产脂肪酶，然后发酵时间过长(大于72小时)，生产周期偏长。
技术实现思路
针对现有的技术的以上缺陷和改进需求，本专利技术提供一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶及其表达菌株，以实现减短饲料用脂肪酶的生产周期，降低生产的成本。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株，由下述方法制得：(1)将脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述脂肪酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(2)将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，挑选阳性克隆，获得重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。进一步地，所述载体为pHT43。所述枯草芽孢杆菌为WB800N。第二方面，本专利技术提供了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶，以表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备脂肪酶。进一步地，所述发酵方法为：将表达菌株置于装液量20-40％的培养摇瓶中，在200～220rpm的转速下以摇床培养，培养温度37℃、培养时间6～16h，培养基中各成分含量为：淀粉0.15wt％、葡萄糖0.5wt％、尿素0.1wt％、磷酸氢二钾0.3wt％、磷酸二氢钾0.15wt％、硫酸镁0.05wt％、酵母膏0.02wt％、氯化铁0.01wt％、碳酸钙0.01wt％、豆粕1wt％、30.8mg/L浓度的硫酸锰溶液0.1vol％。培养摇瓶的装液量为30％，脂肪酶的产率较高，尤其是当培养时间为16h，转速为200rpm，产率达到109.3U/mL。脂肪酶活力检测方法为：取4mL橄榄油乳化液和5mLTris-HCl缓冲液(pH8.0)加至50mL的锥形瓶中，40℃水浴预热5min，加入适当稀释的酶上清液1mL，反应体系为10mL，40℃，200rpm水浴摇床中反应10min后加入15mL终止液终止反应。酶水解反应产生的脂肪酸通过0.05MNaOH滴定，加入两滴0.5％的酚酞溶液指示滴定终点。每分钟水解产生1μmol游离脂肪酸定义为一个活力单位U。酶活计算公式为：U＝(V2-V1)*10-3*M*106*N/T其中：V1：对照组达到滴定终点消耗NaOH体积(mL)；V2：实验组达到滴定终点消耗NaOH体积(mL)；M：滴定所用NaOH溶液的浓度(M)；N：酶上清液稀释倍数；T：反应时间(min)。第三方面，本专利技术提供了一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶作为饲料添加剂的应用。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得以下有益的效果：通过基因工程重组技术，建立了解脂耶氏酵母脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB800N的表达，最终实现了饲料用脂肪酶的高效生产，经验证重组脂肪酶的产量为109.3U/mL。将上述重组解脂耶氏酵母脂肪酶作为饲料添加剂应用于饲料生产，生物安全性好，发酵周期短，能耗低，条件温和等明显优势，极具农业应用的前景。附图说明图1为重组质粒pHT43-Lip示意图。具体实施案例为了使本专利技术的目的、技术方案更佳清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅有以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：(1)以来源于解脂耶氏酵母脂肪酶家族中的脂肪酶Lip(具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)为目标脂肪酶基因，以pHT43为质粒载体，通过酶切酶联构建重组质粒pHT43-Lip，酶切位点位BamHI和SmaI；(2)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB800N；(3)在含有氨苄霉素的固体LB培养基上，筛选阳性克隆，获得高产的重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。实施例2将实施例1获得枯草芽孢杆菌工程菌株在①号液体培养基中发酵，摇瓶装液量20vol％，摇床转速220rpm，培养温度37℃，培养时间为6h，获得的脂肪酶具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。脂肪酶活力达到37.5U/mL，①号液体培养基的基质为去离子水，各成分含量为：淀粉0.15wt％、葡萄糖0.5wt％、尿素0.1wt％、磷酸氢二钾0.3wt％、磷酸二氢钾0.15wt％、硫酸镁0.05wt％、酵母膏0.02wt％、氯化铁0.01wt％、碳酸钙0.01wt％、豆粕1wt％、30.8mg/L浓度的硫酸锰溶液0.1vol％。实施例3将实施例1获得枯草芽孢杆菌工程菌株在①号液体培养基中发酵，摇瓶装液量30vol％，摇床转速220rpm，培养温度37℃，培养时间为6h，获得的脂肪酶具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。脂肪酶活力达到76.2U/mL。实施例4将实施例1获得枯草芽孢杆菌工程菌株在①号液体培养基中发酵，摇瓶装液量40vol％，摇床转速220rpm，培养温度37℃，培养时间为6h，获得的脂肪酶具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。脂肪酶活力达到49.3U/mL。实施例5将实施例1获得枯草芽孢杆菌工本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株，其特征在于，由下述方法制得：(1)将脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述脂肪酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(2)将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，挑选阳性克隆，获得重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。
【技术特征摘要】
1.一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株，其特征在于，由下述方法制得：(1)将脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述脂肪酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(2)将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌中，挑选阳性克隆，获得重组解脂耶氏酵母脂肪酶表达菌株。2.如权利要求书所述的表达菌株，其特征在于，所述载体为pHT43。3.如权利要求书所述的表达菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为WB800N。4.一种重组解脂耶氏酵母脂肪酶，其特征在于，以权利要求1获得的表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备脂肪酶。5.根据权利要求4所述的脂肪酶，其特征在于，所述发酵方法为：将表达菌株置于装液量20-...
【专利技术属性】
技术研发人员：费辉，钱世超，吴振举，
申请(专利权)人：杭州柏普泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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