一种维生素B12免疫法测定方法及其试剂技术

本发明专利技术是一种均相酶测定技术的免疫学检测的方法及其试剂，用于测定样品中维生素B12（Vitamin B12，VB12）的含量。该方法采用抗VB12特异性抗体、酶‑VB12复合物，利用酶‑VB12复合物与抗VB12特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‑VB12复合物活性受到抑制，通过测定反应体系中酶活性的变化，从而得到结合的酶标记物数量，从而得到待测样品中VB12的含量。该方法的优点是可以像普通生物化学酶方法一样，实现免疫学测定，从而在全自动生化分析仪上同时测定多个样品。

A method of vitamin B12 immunoassay and its reagent

The present invention is an immunoassay method and reagent for homogeneous enzyme assay technology. It is used to determine the content of vitamin B12 (Vitamin B12, VB12) in samples. The method uses anti-VB12 specific antibody and enzyme-VB12 complex to react with anti-VB12 specific antibody to form antigen-antibody complex. The activity of enzyme-VB12 complex is inhibited. The number of binding enzyme markers is obtained by measuring the change of enzyme activity in the reaction system. The content of VB12 in the sample was obtained. The advantage of this method is that it can be used for immunoassay, just like the common biochemical enzyme method, so that multiple samples can be simultaneously determined on a fully automatic biochemical analyzer.

【技术实现步骤摘要】
一种维生素B12免疫法测定方法及其试剂
本专利技术涉及到小分子与蛋白质定向连接、小分子成分和检测方法，属于医学免疫体外诊断领域。是基于均相的免疫学酶法测定。尤其涉及一种检测方法和试剂盒的制备，特别是一种VB12检测试剂及其制备和检测方法。
技术介绍
维生素B12又称氰钴胺素、钴胺素、外源因子、动物蛋白因子，是唯一含有矿物质的维生素，是一种人体通过饮食获得的必需的营养物质，参与各种代谢过程，促进红细胞的成熟和维持神经系统的正常功能。其缺乏可以引起疲劳、头晕和味觉下降等各种临床表现，但由于症状较分散，容易被忽视，因此血中维生素B12浓度的检测对于判断维生素B12缺乏至关重要。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12在体内具有许多重要的生物学功能：1、促进甲基转移；2、促进红细胞的发育和成熟，使肌体造血机能处于正常状态，预防恶性贫血，维护神经系统健康；3、以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；4、具有活化氨基酸的作用和促进核酸的生物合成，可促进蛋白质的合成，它对婴幼儿的生长发育有重要作用；5、代谢脂肪酸，使脂肪、碳水化合物、蛋白质被身体适当运用；6、消除烦躁不安，集中注意力，增强记忆及平衡感；7、是神经系统功能健全不可缺少的维生素，参与神经组织中一种脂蛋白的形成。大量的研究表明维生素B12贫乏也是巨幼红细胞性贫血症的诱因，同时也与老年痴呆症、抑郁症以及冠心病等有关。维生素B12缺乏也是怀孕早期流产、反复性流产的危险因素之一。近十年来，尤其随着多中心、大规模的社区随机对照研究的开展，表明检测维生素B1水平在贫血、神经系统疾病、出生缺陷、评价指标、营养强化等方面具有重要意义。目前，定量测定VB12的方法，有微生物学法，高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)以及放射免疫法(RIA)。微生物法的优点是成本低，能够检测到极低浓度的叶酸或B12水平，缺点是由于微生物法不能够区分叶酸或B12，准确度较低，重复性较差，无法形成统一标准；高效液相色谱法，仪器昂贵，通量小，需要专业技术人员；放射免疫存在放射线辐射和污染等问题。酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)均受样本基质、缓冲体系以及pH影响较大，不同试剂盒检测结果偏差较大，不利于仪器自动化和标准化。抗VB12抗体的制备难度较高，存在特异性不好的缺点。与维生素B1，维生素B2，维生素B6以及叶酸等存在较大的交叉反应，特异性差，制备的试剂特异性差。有文献报道类似VB12这种小分子的半抗原制备方法决定了制备的抗体的特异性和亲和力。小分子同载体蛋白的连接位点决定了制备抗体的特异性，要保证小分子的特异性抗原决定簇不在半抗原偶联过程中被破坏。载体蛋白同半抗原合适的连接臂长度能够保证小分子的充分暴露，如果过长，会大大降低小分子的免疫原性，太短，载体蛋白会影响小分子的结构。本专利技术采用特异性的连接臂，通过连接位点的定向选择，羧基位点或者氨基位点，充分暴露VB12的免疫位点，从而获得高亲和力及高特异性的抗体。本专利技术还采用特异性的连接载体兔白蛋白、人白蛋白和鼠白蛋白，而不采用通用的连接载体如牛血清白蛋白，血蓝蛋白和甲状腺球蛋白等，主要是因为与牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白等耦联的VB12刺激产生的抗血清也含有针对牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白等的抗体，可能导致假阳性结果；而血蓝蛋白的分子量较大，偶联得到的半抗原容易影响甚至屏蔽小分子的抗原表位，造成制备的抗体亲和力低。而使用兔血清白蛋白做载体免疫的兔子不太可能产生针对兔子自身的蛋白的抗体，且亲和力和特异性更优于其他载体。目前市场上缺乏灵敏度高、特异性强的VB12检测试剂，尤其是适合自动化检验的试剂。本专利技术采用酶偶联VB12复合物，与抗VB12特异性抗体免疫学反应，形成抗原抗体复合物后，酶‐VB12复合物的活性就受到抑制。样品中的VB12与酶‐VB12复合物竞争性结合抗VB12特异性抗体。样品中的VB12越多，结合的抗体就越多。酶‐VB12复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化,可以得到样品中VB12的含量。检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，具有较高的应用价值。
技术实现思路
本检测方法基于免疫学反应，采用均相免疫的酶学测定方法，将小分子VB12与酶通过蛋白质连接技术形成复合物，与样品中的待测VB12与抗VB12特异性抗体竞争结合，通过酶活性的高低来实现样品中VB12浓度的检测。该方法可以提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中VB12含量的均相酶免疫检测试剂及其制备方法。该试剂可应用于临床中广泛使用的各种类型的自动生化分析仪，从而达到大规模样品的测定要求，提高了实用性。本专利技术提供了检测VB12的试剂盒，包含试剂R1，试剂R2，缓冲液，稳定剂，VB12参考标准品的液体试剂盒或包含试剂R1，试剂R2，VB12参考标准品的干粉试剂盒。进一步的，一个优选的技术方案是：一种VB12均相免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗VB12特异性抗体、用于检测抗VB12特异性抗体‐VB12复合物的检测试剂制备及检测方法；上述VB12均相免疫检测试剂盒基于以下原理：含有VB12的生物样品同VB12‐G6PDH酶复合物竞争结合抗VB12特异性抗体；VB12‐G6PDH酶复合物与抗VB12特异性抗体形成免疫结合物后，其催化底物葡萄糖‐6‐磷酸的活性降低或丧失，反应产物NADH的量也降低；测定样品中VB12的浓度量越高，竞争到的抗VB12特异性抗体越多，抗VB12特异性抗体对VB12‐G6PDH酶复合物的活性抑制越低，则反应生成的NADH量越多；根据测定NADH的量计算，从而得到样品中的VB12含量。根据这一专利技术目的，进一步的一个优选实施方案：其中制备VB12免疫原用于制备抗VB12特异性抗体。优选的利用VB12的羟基基团同载体蛋白交联，优选连接基团-CO-(CH2)n-COO-，优选n为2～6；载体蛋白优选兔白蛋白；免疫动物优选新西兰大白兔；化学偶联方式优选琥珀酸酐法和碳二亚胺法；上述优选方法制备的抗VB12特异性抗体对VB12亲和力高，特异性好，与维生素B1，维生素B2，维生素B6以及叶酸均无交叉反应。根据这一专利技术目的的一个优选实施方案，其中制备VB12-酶复合物用于测定VB12测定试剂盒。优选的酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49)；优选的采用VB1羟基基团同葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联，-CO-(CH2)n-COO-，优选n＝2～4；VB12与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的交联方法优选混合酸酐法；VB12与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶交联的酶活保护剂优选葡萄糖-6-磷酸NADH；上述保护剂葡萄糖-6-磷酸优选浓度10mM-100mM，NADH优选浓度为10-100mM；采用合理的酶保护剂，优先占据G6PDH的酶活性中心，避免VB12-G6PDH偶联过程中酶活中心的破坏而导致的酶活丧失。根据这一专利技术目的的一个优选实施方案，其中VB12测定试剂盒中R1试剂缓冲液优选甘氨酸缓冲液；PH优选4.0‐8.0；葡萄糖‐6‐磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定样品中VB12的方法，由试剂R1、试剂R2和VB12参考标准品的组成，其特征在于，（a）试剂R1中含有抗VB12特异性抗体、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（b）试剂R2含有酶‑不对称二甲基精氨酸复合物、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（c）当试剂R1和R2反应时，样品中的VB12与酶‑VB12复合物竞争性结合抗VB12特异性抗体，样品中的VB12越多，结合的抗体就越多，酶‑VB12复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化，可以得到样品中VB12的含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定样品中VB12的方法，由试剂R1、试剂R2和VB12参考标准品的组成，其特征在于，（a）试剂R1中含有抗VB12特异性抗体、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（b）试剂R2含有酶-不对称二甲基精氨酸复合物、缓冲剂、酶反应底物、稳定剂、防腐剂和表面活性剂；（c）当试剂R1和R2反应时，样品中的VB12与酶-VB12复合物竞争性结合抗VB12特异性抗体，样品中的VB12越多，结合的抗体就越多，酶-VB12复合物结合的抗体就越少，通过测定反应体系中酶活性的变化，可以得到样品中VB12的含量。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：许秀丽，吴鸣月，王艳新，
申请(专利权)人：北京丹大生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11