基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法技术

本发明专利技术公开一种基于核酸染料TOTO‑1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本方法步骤如下：1）细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞溶液；2）将裂解后的细胞溶液加入端粒酶扩增缓冲溶液，对端粒酶引物进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；3）加入TS primer的互补序列，杂交后，再加ExoⅢ酶切除双链，最后加TOTO‑1，孵育，检测荧光光谱。本发明专利技术利用了TOTO对含G碱基DNA链的识别作用来检测端粒酶，简化了检测方法，避免了标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明专利技术具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

Detection of telomerase activity based on nucleic acid dye TOTO-1 for fluorescence enhancement of single stranded G sequences

The invention discloses a method for detecting telomerase activity based on fluorescence enhancement of single-chain G sequence by nucleic acid dye TOTO_1. The steps of this method are as follows: 1) Cell culture and telomerase extraction to obtain the lysed cell solution; 2) Add the lysed cell solution to the telomerase amplification buffer solution, and amplify the telomerase primers to obtain the repeated G-rich sequence of the product solution; 3) Add the complementary sequence of TS primer, hybridization, and then add Exo 1 enzyme was used to remove the double strands, and finally TOTO was added to incubate and detect the fluorescence spectrum. The invention uses TOTO to detect telomerase by recognizing DNA strand containing G base, simplifies the detection method, avoids the defects of high detection cost, complicated operation and poor reproducibility caused by labeling DNA probe. The invention has the advantages of low cost, high speed, convenience and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法
本专利技术属于生物传感
，涉及一种荧光法定量检测端粒酶的技术，具体涉及基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。
技术介绍
传统的检测方法主要是利用聚合酶链式反应(PCR)法对端粒的重复序列进行扩增。此方法稳定性好，特异性高，但是需要样品量较大，灵敏性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测。此外，TRAP法需要使用昂贵的设备和试剂，再加上端粒酶抑制剂的开发已被提议作为人类癌症治疗的潜在方法，而TRAP在筛选有效的端粒酶抑制剂时易受PCR派生产物的影响，因此，该方法存在很多局限性。荧光不仅价格便宜，不需要复杂的仪器设备，而且测量简便、快速，因而得到了较快的发展。虽然后续有一些研究者提供了很多方法来检测端粒酶，但是大多数需要借助纳米材料制备、比较贵重的仪器或比较复杂的荧光循环步骤，考虑到生物体本身复杂的环境，涉及的物质和操作过程越多，实验的重现性和准确性越差。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本专利技术针对TOTO-1与TSPrimer扩增后的链结合荧光强度会发生明显变化，从而建立荧光法检测端粒酶，同时结合ExoⅢ来降低该实验方案的背景干扰，通过荧光强度的改变可以对端粒酶进行定量检测。本专利技术是利用TOTO-1对TSPrimer扩增出的富G序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入ExoⅢ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。技术方案：本专利技术提供了一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：1)细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；2)将裂解后的细胞溶液加入含有端粒酶扩增引物(TSprimer)的端粒酶缓冲溶液，对TSprimer进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；3)在产物溶液中加入TSprimer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；4)在杂交好的产物中再加ExoⅢ酶切除双链，最后加TOTO-1，孵育，检测荧光光谱。其中，所述步骤1)的细胞的培养以及提取端粒酶的提取具体步骤如下：A549肺癌细胞加入含10％FBS和双抗的DMEM培养基，在含5％CO2，37℃细胞培养箱培养后收集，4×106个细胞分散在1.5mL的EP管中，用1×PBS在1800rpm离心机清洗5min后，弃去上清液，将这些收集到的细胞分散在裂解液中，冰上孵育30min后，12000rpm，4℃下离心20min，将上清液转移到无RNase离心管，快冻后保存在-80℃冰箱中。其中，所述步骤1)细胞数目为2～4000个。其中，所述步骤2)具体步骤如下：用端粒酶缓冲溶液将细胞配置成不同的浓度，在含有dNTPs、端粒酶扩增引物的端粒酶缓冲溶液中滴加不同浓度的裂解后的细胞溶液对其引物进行扩增延伸，37℃反应1～2h。其中，所述步骤2)端粒酶缓冲溶液为含有MgCl2、EGTA、Tween20的pH8.3的20mMTris-HCl，所述MgCl2初始浓度为1～5mM，EGTA初始浓度为0.05～5mM，Tween20初始浓度为0.005％～1％(v/v)，dNTPs初始浓度为0.5～2mM。其中，所述步骤2)的TSprimer的序列如SEQIDNO：1所示，所述TSprimer的浓度为1～6μM。其中，所述步骤2)细胞裂解液的细胞浓度为2～4000个cells/mL。其中，所述步骤3)具体如下：将TSprimer的互补序列加入到已扩增好的引物中，再加入杂交缓冲液，置于95℃水浴5min后渐渐冷却至室温。其中，所述步骤3)的杂交缓冲溶液为含有NaCl、EDTA的Tris-HCl，所述NaCl初始浓度为50mM，EDTA的初始浓度0.1～1mM。其中，所述步骤3)的TSprimer的互补序列终浓度为0.5～1μM。其中，所述步骤4)具体如下：取杂交好的产物，加ExoⅢ酶，37℃反应1～2小时，取TOTO-1加入到上述反应物中，定容至200μL，对其溶液进行记录和荧光光谱检测；其中，步骤4)中的ExoⅢ酶的终浓度为0.5～3U/μL，所述步骤4)的核酸染料TOTO-1浓度为25～300nM。有益效果：本专利技术是利用核酸染料TOTO-1对TSPrimer扩增出的富G序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入ExoⅢ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。本专利技术原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器。将该方法用于肿瘤患者实际样品时，与临床诊断结果一致。所以可以将该方法进一步开发，做成一种小型诊断仪器，方便患者使用，定时诊断，将肿瘤细胞扼杀在早期。附图说明图1基于TOTO-1荧光检测端粒酶活性的流程图；图2端粒酶检测原理验证图；图2A，a：PolyADNA与TOTO-1的荧光光谱；b：PolyC与TOTO-1的荧光光谱；c：PolyT与TOTO-1的荧光光谱；d：PolyG与TOTO-1的荧光光谱；e：dsDNA与TOTO-1的荧光光谱；图2B，a：TOTO-1；b：ds经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育的荧光强度；c：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs与TOTO-1孵育的荧光强度；d：ds经过ExoⅢ酶切后产物，A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度；e：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs，热处理A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度；f：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs，A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度；图2C，a：TOTO-1的荧光强度；b：TOTO-1与A549细胞的荧光强度；c：TOTO-1与dNTPs的荧光强度；d：ds经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育的荧光强度；e：TOTO-1与TSprimer的荧光强度；f：TOTO-1与TSprimer互补DNA的荧光强度；图2D，a:TSPrimer与其互补序列杂交后加ExoⅢ酶切后产物加TOTO-1的荧光光谱；b：TSPrimer经端粒酶扩增后产物与TSPrimer互补序列杂交后加ExoⅢ酶切后产物加TOTO-1的荧光光谱；c：TSPrimer加TOTO-1的荧光光谱；d：TSPrimer经端粒酶扩增后产物加TOTO-1的荧光光谱。图3检测端粒酶活性的条件优化图：A：TSPrimer的浓度优化；B：TOTO-1的浓度优化；C：ExoⅢ酶浓度优化；D：ExoⅢ酶切时间优化。图4检测端粒酶活性的荧光强度值变化图：图4A：在不同的A549细胞浓度下，得到的紫外-可见光曲线图(A549细胞浓度：(a)0(b)2(c)7(d)13(e)40(f)320(g)750(h)2000cells/mL)(i)4000cells/mL；图4B：荧光强度与A549细胞浓度的标准曲线；插图：荧光强度与A549细胞浓度之间的线性关系；从图中可以看出A549细胞在2cells/mL到4000cells/mL呈良好的线性关系。图5端粒酶选择性验证；图6BIBR和姜黄素两种抑制剂对端粒酶的抑制作用，图6A:不同浓度BIBR对端粒酶的抑制作用(BIBR浓度：10,100,200本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于核酸染料TOTO‑1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；2)将裂解后的细胞溶液加入含有TS primer的端粒酶缓冲溶液，对TS primer进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；3)在产物溶液中加入TS primer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；4)杂交好的产物中再加入ExoⅢ酶切除双链，最后加入核酸染料TOTO‑1孵育，检测荧光光谱。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；2)将裂解后的细胞溶液加入含有TSprimer的端粒酶缓冲溶液，对TSprimer进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；3)在产物溶液中加入TSprimer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；4)杂交好的产物中再加入ExoⅢ酶切除双链，最后加入核酸染料TOTO-1孵育，检测荧光光谱。2.根据权利要求1所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤1)细胞数目为2～4000个。3.根据权利要求1所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2)具体步骤如下：用端粒酶缓冲溶液将裂解后的细胞溶液配置成不同的浓度，在含有dNTPs、端粒酶扩增引物的端粒酶缓冲溶液中滴加不同浓度的裂解后的细胞溶液对其引物进行扩增延伸，37℃反应1～2h。4.根据权利要求3所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2)端粒酶缓冲溶液为含有MgCl2、EGTA、Tween20的Tris-HCl，所述MgCl2初始浓度为1～5mM，EGTA初始浓度为0.05～5mM，Tween20初始浓度为0.005％～1％，d...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫伟，杨海堂，刘松琴，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32