一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法，包括如下步骤：(1)将人骨髓小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液上层，4℃条件2000r/min离心20min，吸取分离液和血浆界面云雾状的单个核细胞层，用无血清IMDM悬浮后，以1000r/min离心，按2×105/cm2密度接种于培养瓶中培养，48h后换液，将不贴壁的细胞洗去，贴壁细胞每3d换液，待细胞融合度达80％以上时，用胰酶消化传代；(2)取传代细胞以2×104/cm2的密度接种于含有无血清IMDM的培养瓶中，37℃，5％CO2培养48h后，加入miR‑196a表达抑制剂继续培养24～72h。本发明专利技术提供的方法比常规培养方法具有更高的骨髓间充质干细胞增殖率，有助于较快获得大量骨髓间充质干细胞用于干细胞移植等手术治疗。

A method to increase the proliferation rate of bone marrow mesenchymal stem cells

The invention discloses a method for improving the proliferation rate of bone marrow mesenchymal stem cells, which comprises the following steps: (1) carefully superimposing the human bone marrow on the upper layer of the equal volume lymphocyte isolation solution, centrifuging it for 20 minutes under the condition of 2000 r/min at 4 C, absorbing the cloud-like mononuclear cell layer at the interface of the isolation solution and plasma, suspending it with serum-free IMDM, and then suspending it with 1000 R / min centrifugation, inoculated in a culture flask at a density of 2 *105/cm2. After 48 hours, the adherent cells were washed off, and the adherent cells were digested and passaged with trypsin every 3 days when the cell fusion degree was above 80%. (2) The passaged cells were inoculated in a culture flask containing serum-free IMDM at a density of 2 *104/cm2, 37 C and 5% CO2. After 48h was cultured, miR - 196a expression inhibitor was added to 24 to 72h. The method provided by the invention has higher proliferation rate of bone marrow mesenchymal stem cells than the conventional culture method, and is helpful to obtain a large number of bone marrow mesenchymal stem cells quickly for surgical treatment such as stem cell transplantation.

【技术实现步骤摘要】
一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法
本专利技术属于生物领域，涉及一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法。
技术介绍
骨髓间充质干细胞来源方便，能在体外培养、增殖，可分化为多种细胞，且可分泌多种营养因子和调节免疫等功能，故可成为临床疾病的辅助治疗手段。研究表明，miR-196a可抑制骨髓间充质干细胞的增殖，抑制miR-196a的表达可以促进骨髓间充质干细胞的增殖(参考文献：MicroRNA-196a通过HOXB7调控人骨髓间充质干细胞的增殖功能，中国病理生理杂志，2014年30卷第2期，278-285)。因此，若在培养骨髓间充质干细胞时添加适量miR-196a表达抑制剂，可提高骨髓间充质干细胞增殖率，以大量获得骨髓间充质干细胞。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法。上述目的通过如下技术方案实现：一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法，包括如下步骤：(1)骨髓间充质干细胞的分离培养：将人骨髓小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液上层，4℃条件2000r/min离心20min，吸取分离液和血浆界面云雾状的单个核细胞层，用无血清IMDM悬浮后，以1000r/min离心，按2×105/cm2密度接种于培养瓶中培养，48h后换液，将不贴壁的细胞洗去，贴壁细胞每3d换液，待细胞融合度达80％以上时，用胰酶消化传代；(2)骨髓间充质干细胞的诱导增殖：取传代细胞以2×104/cm2的密度接种于含有无血清IMDM的培养瓶中，37℃，5％CO2培养48h后，加入miR-196a表达抑制剂继续培养24～72h。优选地，所述miR-196a表达抑制剂为掌叶半夏碱D。优选地，取第3～5代传代细胞用于诱导增殖。一种促进骨髓间充质干细胞增殖的IMDM培养基，添加有miR-196a表达抑制剂。优选地，miR-196a表达抑制剂为掌叶半夏碱D。本专利技术提供的方法比常规培养方法具有更高的骨髓间充质干细胞增殖率，有助于较快获得大量骨髓间充质干细胞用于干细胞移植等手术治疗。附图说明图1为各组骨髓间充质干细胞增殖率(％)及miR-196a相对表达水平。具体实施方式下面结合具体实施例介绍本专利技术的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。一、实验材料掌叶半夏碱D(CAS登录号：163046-71-7)、掌叶半夏碱E(CAS登录号：163181-57-5)标准品的纯度均在98％以上。IMDM培养基购于Gibco公司。CCK-8试剂盒购于日本同仁。PrimeScripRTMasterMix(反转录试剂盒)、SYBRPremixExTaq(荧光定量PCR试剂盒)均购自大连宝生物公司。二、实验方法1、骨髓间充质干细胞的分离培养将人骨髓小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液上层，4℃条件2000r/min离心20min，吸取分离液和血浆界面云雾状的单个核细胞层，用无血清IMDM悬浮后，以1000r/min离心，按2×105/cm2密度接种于培养瓶中培养，48h后换液，将不贴壁的细胞洗去，贴壁细胞每3d换液，待细胞融合度达80％以上时，用胰酶消化传代。2、骨髓间充质干细胞的诱导增殖取第4代传代细胞以2×104/cm2的密度接种于接种于96孔培养板，培养于无血清IMDM培养基中，37℃，5％CO2培养48h后，分组培养：掌叶半夏碱D组：在无血清IMDM培养基中添加终浓度为25μM掌叶半夏碱D；掌叶半夏碱E组：在无血清IMDM培养基中添加终浓度为25μM掌叶半夏碱E；对照组：仅仅为无血清IMDM。培养48h后，每孔加入细胞计数试剂盒中的CCK-8溶液10μL，在细胞培养箱内继续孵育2h后，分别用酶标仪在450nm测定吸光度。每组实验重复3次。分别计算掌叶半夏碱D组、掌叶半夏碱E组比对照组细胞浓度提高百分比作为掌叶半夏碱D、E的诱导增殖率(％)。3、RT-qPCR法检测掌叶半夏碱D、E对骨髓间充质干细胞miR-196a相对表达水平影响取第4代传代细胞以2×104/cm2的密度接种于接种于6孔培养板，培养于无血清IMDM培养基中，37℃，5％CO2培养48h后，按照上述方法分组继续培养48h，离心收集细胞。加入Trizol提取细胞总RNA，测定浓度后，用PrimeScripRTMasterMix(反转录试剂盒)，按照500ng/10μl的体系反转录成50μl的cDNA，用SYBRPremixExTaq(荧光定量PCR试剂盒)以20μl体系在ABI7500实时荧光定量PCR仪上检测miR-196a相对表达量。用β-actin基因表达水平作为内参，计算miR-196a/β-actin基因的比值代表miR-196a的相对表达水平，基因表达相对定量计算采用仪器自带软件。引物序列如下：4、统计学分析数据处理采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，结果以均数±标准差表示，组间比较P＜0.05认为有统计学差异。三、实验结果掌叶半夏碱D组、掌叶半夏碱E组骨髓间充质干细胞的诱导增殖率分别为(88.2±4.0)％、(5.3±3.2)％；与对照组相比，掌叶半夏碱D组骨髓间充质干细胞中miR-196a相对表达水平(0.37±0.08)显著降低，掌叶半夏碱E组miR-196a相对表达水平(0.97±0.07)与对照组(1.00±0.05)无显著差异。结果如图1所示。该结果表明，掌叶半夏碱D可以通过抑制miR-196a表达促进骨髓间充质干细胞增殖，而掌叶半夏碱E不具有这种作用。因此，掌叶半夏碱D可以用作骨髓间充质干细胞增殖促进剂，可以添加到IMDM培养基中制备成骨髓间充质干细胞高增殖培养基。上述具体实施例仅用于解释本专利技术的技术方案，本领域技术人员应当明白，本专利技术的保护范围并不受限于上述具体实施例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)骨髓间充质干细胞的分离培养：将人骨髓小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液上层，4℃条件2000r/min离心20min，吸取分离液和血浆界面云雾状的单个核细胞层，用无血清IMDM悬浮后，以1000r/min离心，按2×105/cm2密度接种于培养瓶中培养，48h后换液，将不贴壁的细胞洗去，贴壁细胞每3d换液，待细胞融合度达80％以上时，用胰酶消化传代；(2)骨髓间充质干细胞的诱导增殖：取传代细胞以2×104/cm2的密度接种于含有无血清IMDM的培养瓶中，37℃，5％CO2培养48h后，加入miR‑196a表达抑制剂继续培养24～72h。

【技术特征摘要】
1.一种提高骨髓间充质干细胞增殖率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)骨髓间充质干细胞的分离培养：将人骨髓小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液上层，4℃条件2000r/min离心20min，吸取分离液和血浆界面云雾状的单个核细胞层，用无血清IMDM悬浮后，以1000r/min离心，按2×105/cm2密度接种于培养瓶中培养，48h后换液，将不贴壁的细胞洗去，贴壁细胞每3d换液，待细胞融合度达80％以上时，用胰酶消化传代；(2)骨髓间充质干细胞的诱导增殖：取传代细胞以2×...

【专利技术属性】
技术研发人员：田红青，
申请(专利权)人：南京千年健干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32