一种抗缺氧损伤的干细胞制剂及其制备方法与在制备治疗急性心梗药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种抗缺氧损伤的干细胞制剂及其制备方法与在制备治疗急性心梗药物中的应用，所述抗缺氧损伤的干细胞制剂的制备方法为，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂。本发明专利技术提供的Fstl1修饰的MSCs具有优异的抗缺氧损伤能力，可提高移植存活率，经心肌直接注射可有效提高梗死后心功能。

A Stem Cell Preparation for Anti-hypoxic Injury and Its Preparation and Application in Preparation of Drugs for Acute Myocardial Infarction

The invention discloses a stem cell preparation for anti-hypoxic injury and its preparation method and application in the preparation of medicine for acute myocardial infarction. The preparation method of the stem cell preparation for anti-hypoxic injury is that the stem cell and Fstl1 overexpression lentivirus solution are mixed in the culture medium to obtain the stem cell preparation for anti-hypoxic injury. The MSCs modified with Fstl1 have excellent anti-hypoxia injury ability, can improve the survival rate of transplantation, and can effectively improve the cardiac function after infarction by direct myocardial injection.

【技术实现步骤摘要】
一种抗缺氧损伤的干细胞制剂及其制备方法与在制备治疗急性心梗药物中的应用
本专利技术属于细胞药物技术，具体涉及一种抗缺氧损伤的干细胞制剂及其制备方法与在制备治疗急性心梗药物中的应用。
技术介绍
心肌梗死是一种严重危害人类健康的心血管疾病，随着我国人民生活水平的不断提高，缺血性心肌梗死的发病率也在不断上升。缺血性心肌梗死会导致心肌细胞坏死和瘢痕形成，进而影响心脏功能。目前药物或器械治疗大多只能缓解症状，但却不能逆转心脏组织损伤。心脏移植虽能彻底改善心脏状态，但因供体来源稀缺、免疫排斥以及昂贵的治疗费用等因素，在临床上很难广泛应用。干细胞移植治疗心肌梗死，因其各方面的优势有望成为治疗心肌梗死的重要治疗手段。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）是一种来源丰富且容易获得的原代成体干细胞，主要存在于骨髓、脂肪、脐带、胎盘和羊水等组织中。近年来，MSCs因其卓越的组织修复能力，常作为细胞移植的种子细胞广泛应用于再生医学领域。多项研究证实MSCs主要依赖旁分泌发挥作用。目前困扰干细胞移植的瓶颈问题系干细胞移植存活率低，因此，如何最大限度提高干细胞存活率是该领域的研究热点。心肌梗死局部恶劣的缺氧微环境是造成移植干细胞存活率低的主要原因，因此提高干细胞的抗缺氧损伤能力是未来的努力方向。卵泡抑素样蛋白1（Follistatinlike1，Fstl1）最初从小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中克隆获得，是一种分泌型胞外糖蛋白，并不参与细胞外基质结构，而是在细胞外水平通过改变细胞微环境调节细胞生理活动。Fstl1是维持心脏稳态与病理重塑的重要内源性活性因子，在心脏广泛表达。作为慢性收缩性心衰左室重塑的标志物，Fstl1可降低压力超负荷导致的病理性心脏肥大；但是Fstl1是否可以提高干细胞的抗缺氧损伤能力，进而提高移植细胞的驻留尚不明确。
技术实现思路
本专利技术公开了一种抗缺氧损伤的干细胞制剂及其制备方法与在制备治疗急性心梗药物中的应用。本专利技术采用如下技术方案：一种抗缺氧损伤的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，10～15小时后换液，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂。本专利技术还公开了一种预防或治疗心梗药物的制备方法，包括以下步骤，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，10～15小时后换液，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂；将抗缺氧损伤的干细胞制剂与分散介质，比如缓冲液、生理盐水混合，得到预防或治疗心梗药物；具体的给药方式可采取直接心肌注射或各种途径的经血注射等。优选的，在聚凝胺（polybrene）存在下，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，以增加病毒感染效率，polybrene的终浓度为8μg/ml。上述技术方案中，干细胞为小鼠骨髓间充质干细胞；按照感染复数（multiplicityofinfection，MOI）=10计算Fstl1过表达慢病毒液的用量。Fstl1过表达慢病毒液中，Fstl1过表达慢病毒滴度为107～108TU/ml；培养基一般为DMEM/F12培养基。优选的，选择2-3周龄的雄性C57BL/6J小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠浸泡在75%酒精中10min；无菌条件下取小鼠双下肢浸泡于DMEM/F12无血清基础培养基中，去除股骨及胫骨表面肌肉；用1ml注射器吸取添加青/链霉素的DMEM/F12无血清基础培养基并冲洗骨髓腔；待骨髓全部冲出后离心弃上清，加入新鲜的小鼠骨髓来源MSCs专用培养基反复吹打至单细胞悬液，将细胞悬液接种于培养皿中；72h后换液并去除未贴壁细胞，以后每两天换液一次，待培养皿中的集落互相融合且细胞密度达70%左右时进行传代，此时标记为P1代；待MSCs传至P5代以后，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合以制备抗缺氧损伤的干细胞制剂；优选按照3X105/cm2的密度将细胞悬液接种于培养皿中。优选的，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，12h后换液，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂；更优选的，换液后培养一段时间以获得更多抗氧损伤干细胞，培养时间可以为72h或者更长。本专利技术还公开了根据上述抗缺氧损伤的干细胞制剂的制备方法制备的抗缺氧损伤的干细胞制剂；Fstl1过表达慢病毒在提高干细胞移植存活率中的应用或者Fstl1过表达慢病毒在制备抗缺氧损伤干细胞制剂中的应用。本专利技术制备的抗缺氧损伤的干细胞制剂通过倒置荧光显微镜下观察mCherry荧光判断细胞感染效率，可以发现大部分细胞均显示强烈mCherry荧光，提示慢病毒感染成功。作为一种来源丰富且容易获得的原代成体干细胞，MSCs因其卓越的组织修复能力，常作为细胞移植的种子细胞广泛应用于再生医学领域。但是现有MSCs存在明显的抗缺氧损伤能力弱的问题，导致实际干细胞修复效果远低于理论设计。本专利技术利用Fstl1改造干细胞后可明显提高干细胞抗缺氧损伤能力，从而提高其移植存活率，所以本专利技术还公开了Fstl1在提高干细胞移植存活率中的应用。现有技术研究了Fstl1对心肌梗死的作用，但是没有文献涉及利用Fstl1改造干细胞，也没有关于Fstl1改造干细胞达到何种效果的报道；本专利技术提供Fstl1修饰的MSCs具有优异的抗缺氧损伤能力，可提高移植存活率，因此本专利技术还公开了Fstl1在制备抗缺氧损伤干细胞制剂中的应用；本专利技术还公开了上述抗缺氧损伤的干细胞制剂在制备抗缺氧损伤干细胞体系或者提高干细胞移植存活率中的应用。同时本专利技术公开了抗缺氧损伤的干细胞制剂在制备预防或治疗心梗药物或保健品中的应用。本专利技术的抗缺氧损伤的干细胞制剂具有抵抗心肌梗死局部恶劣的缺氧微环境能力，可成为调控心脏稳态与病理重塑的重要手段。附图说明图1为小鼠骨髓来源MSCs的形态鉴定；图2为小鼠骨髓来源MSCs的流式鉴定；图3为持续缺氧刺激引起MSCs的Fstl1表达显著下降；图4为MSCs-mCherry和MSCs-Fstl1均强烈表达mCherry荧光；图5为MSCs-mCherry和MSCs-Fstl1的流式鉴定；图6为MSCs-Fstl1高表达且高分泌Fstl1；图7为MSCs-Fstl1更有效抵抗缺氧引起的细胞凋亡；图8为MSCs-Fstl1在缺氧环境下的细胞增殖能力更强；图9为MSCs-Fstl1在常氧和缺氧环境下的细胞活力均更佳；图10为MSCs-Fstl1细胞移植显著改善心梗后心功能（M型超声图）；图11为MSCs-Fstl1细胞移植显著促进EF、FS、LVID;d和LVPW;d指标恢复；图12为MSCs-Fstl1细胞移植缩小心梗面积（Masson染色示意图）；图13为MSCs-Fstl1细胞移植有效缩小心梗面积（统计结果）；图14为以mCherry自身荧光和免疫荧光共定位评估移植细胞在缺氧心肌中的驻留；图15为以DiI标记移植细胞来评价移植细胞在缺氧心肌中的驻留。具体实施方式以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。本专利技术中，换液是指将病毒感染液100%换为正常完全细胞培养基。实施例一抗缺氧损伤的干细胞制剂的制备及性能检测所使用的主要材料和来源分别如下：C57BL/6J小鼠（昭衍新药研究中心，此实验由苏州大学伦理委员会批准）；DMEM/F1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗缺氧损伤的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，10～15小时后换液，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂。

【技术特征摘要】
1.一种抗缺氧损伤的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，10～15小时后换液，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂。2.一种预防或治疗心梗药物的制备方法，包括以下步骤，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合，10～15小时后换液，得到抗缺氧损伤的干细胞制剂；将抗缺氧损伤的干细胞制剂与分散介质混合得到预防或治疗心梗药物。3.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，在聚凝胺存在下，将干细胞与Fstl1过表达慢病毒液在培养基中混合。4.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞为鼠骨髓间充质干细胞；按照MOI=10计算Fstl1过表达慢病毒液的用量。5.根据权利要求1或者2所述的制备方法，其特征在于，选择2-3周龄的雄性C57BL/6J小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠浸泡在75%酒精中消毒；无菌条件下取小鼠双下肢浸泡于DMEM/F12无血清基础培养基中，去除股骨及胫骨表面肌肉；用注射器吸取添加青/链霉素的DMEM/F12无血清基础培养基并冲洗骨髓腔...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈维倩，沈晗，崔光浩，沈振亚，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32