与脂肪细胞形成相关的药物的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种与脂肪细胞形成相关的药物的筛选方法，包括以下步骤：Ａ．提供骨髓间质干细胞的特定细胞株和相关的培养条件；Ｂ．对细胞进行基因转染，引导向脂肪细胞分化，检测分化过程中荧光蛋白的表达，以及对细胞进行鉴定；Ｃ．加入待筛选的药物；以及Ｄ．检测荧光蛋白的表达情况，如果出现荧光蛋白表达下调或者上调的情形，该化合物成为与脂肪细胞形成相关的潜在候选药物。本发明专利技术建立了一种与脂肪细胞形成相关的药物的筛选方法，通过绿色荧光蛋白的表达检测可以用来筛选与脂肪细胞形成相关的药物，尤其是用于筛选促进或者抑制脂肪形成的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和细胞生物学领域，涉及一种与脂肪细胞形成相关的药物 的筛选方法，尤其是涉及一种通过荧光报告基因的表达检测来筛选促进或者抑制脂肪细胞 形成的药物的方法。
技术介绍
脂肪形成(Adipogenesis)是指脂肪细胞形成和成熟的过程，在近几年受到越来 越多的关注。脂肪组织的功能包括以脂肪的形式存储能量，更重要的是作为身体最大的内 分泌器官维持机体的稳态。脂肪细胞可以分泌多种激素和细胞因子来调节机体的重要机能 活动，包括糖代谢、脂肪代谢、血管生成、免疫调节和生殖等。脂肪细胞的功能失调可以导致 一系列的代谢相关疾病，包括肥胖症和糖尿病等。具有正性或者负性调节脂肪形成的小分 子化合物有望成为这类疾病的新的治疗药物。目前，有多种与干细胞分化相关的筛选小分子化合物的方法。其中，利用荧光素 酶(Iuciferase)作为报告基因的方法已经得到广泛的应用。已有报道应用该报告基因 进行与干细胞神经分化、心肌分化和成骨分化相关的小分子化合物的筛选。例如，xu等 (Xu Wu，Sheng Ding，Qiang Ding，Nathanael S.Gray and Peter G. Schultz. (2004)Small molecules thatinduce cardiomyogenesis in embryonic stem cells· JACS·)应用大鼠心 肌特异启动子-心房利钠肽(ANF)携带荧光素酶的载体从10万个小分子化合物库筛选心 肌分化的诱导因子。另外还有使用荧光蛋白作为报告基因或者抗体标记的方法进行小分子 的蹄选。例如，Hoio 等(Hironori Ho jo，Kazuyo Igawa，Shinsuke Ohba (2008) Development of high-throughputscreening system for osteogenic drugs using a cell-based sensor. Biochemical and BiophysicalResearch Communications.)应用 I 型胶原启动子 携带绿色荧光蛋白转染小鼠3T3细胞，直接通过荧光显微镜的观察从2500个化合物中筛选 与成骨分化相关的小分子化合物。在干细胞的脂肪分化中，PPARy是主要调节因子，而脂肪酸结合蛋白aP2(FABP4) 主要表达于脂肪细胞和巨噬细胞上，其主要作用是作为脂质转运蛋白结合长链脂肪酸和维 甲酸，并受PPAR Y激动剂、胰岛素和脂肪酸所调节。因此，我们认为使用aP2携带报告基因 的方法是筛选脂肪分化调节因子的快速和敏感的方法。已有研究使用aP2启动子携带荧光 素酶的载体转染3T3-L1细胞的方法筛选PPAR γ的激动剂。然而，如果要寻找治疗人类代 谢疾病的药物，小鼠来源的3T3-L1细胞不是一个理想的模型。而且，荧光素酶的方法虽然 比较成熟，但是费用较高而且步骤繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的用于筛选与脂肪形成相关的药物的方法，具体是通 过以骨髓间质干细胞作为细胞模型，应用脂肪组织特异启动子aP2携带绿色荧光蛋白作为 报告基因的载体进行细胞的转染和分化，最终通过酶标仪的检测读数进行与脂肪形成相关药物的筛选，尤其适用于筛选促进或者抑制脂肪细胞形成的潜在候选药物。本专利技术所述的与脂肪形成相关的药物的筛选方法，包括以下步骤:A.提供骨髓间 质干细胞的细胞株和相关的培养基与培养条件；B.提供带有脂肪组织特异启动子及绿色 荧光蛋白作为报告基因的慢病毒载体，对所述供骨髓间质干细胞进行转染，引导向脂肪细 胞分化，检测分化过程中荧光蛋白的表达，以及对细胞进行鉴定；C.加入待筛选的药物，检 测荧光蛋白的表达情况，如果出现荧光蛋白表达下调或者上调的情形，该化合物成为与脂 肪细胞形成相关的潜在候选药物。所述步骤A中，培养基是通用的哺乳类动物细胞培养液，培养条件是5 % CO2, 37 °C。所述步骤B中，所述分化是用免疫细胞化学、油红0染色观察，所述鉴定是用实时 定量PCR进行鉴定。所述步骤C中，所述待筛选的药物是小分子化合物或者药物。所述步骤D中，所述检测荧光蛋白的表达的方法是用酶标仪进行读数。本专利技术首先构建慢病毒质粒pLVfinal/pgk-puromycin-aP2-hrGFP(意为慢病毒 表达载体，由广泛表达启动子Pgk调控puromycin抗性基因的表达，aP2基因调控hrGFP 的表达)，在293ft细胞(来源于SV40大T抗原转化的人胚肾细胞，一种通用的病毒包 装细胞)进行慢病毒包装，浓缩，随后进行不同种属来源的胚胎干细胞和间质干细胞的转 染和筛选，并在脂肪诱导分化的过程中观察到绿色荧光蛋白的表达，通过免疫荧光化学和 RT-PCR的方法证实表达绿色荧光的细胞为脂肪细胞。目前均未见报道。本专利技术以骨髓间质干细胞为例，通过实验研究骨髓间质干细胞脂肪分化过程中绿 色荧光蛋白的表达变化及其与aP2基因RNA水平的表达和脂滴生成之间的关系。结论是 随着脂肪分化时间的延长，绿色荧光蛋白的表达量逐渐升高(通过酶标仪进行读数检测)， aP2基因RNA水平的表达(通过实时PCR检测)和脂滴形成(通过油红0染色检测)也逐 渐增高，三者之间存在正相关关系。由此，本专利技术将绿色荧光蛋白的表达量作为间质干细胞 脂肪分化的观察和检测指标。因此，建立通过应用脂肪组织特异启动子aP2携带绿色荧光蛋白作为报告基因的 载体进行骨髓间质干细胞的转染和分化，最终通过酶标仪的检测读数来筛选与脂肪形成相 关药物的方法是可行的，也是非常有应用前景的。本专利技术首次提出了这种通过荧光报告基 因的表达检测来筛选促进或者抑制脂肪细胞形成的药物或化合物的方法。本专利技术以小分子化合物作为药物筛选的示例，验证了上述方法的可行性，通过建 立骨髓间质干细胞脂肪分化的模型，在分化过程中加入小分子化合物LW94002、chir99021 和Thiazolidinedione，通过绿色荧光蛋白的检测获得小分子化合物与骨髓间质干细胞脂 肪分化的直接关系，并通过定量PCR检测脂肪特异基因、油红0染色进行脂滴染色等方法 与荧光检测结果相互印证。首次发现绿色荧光蛋白的表达量可以很好地提示脂肪分化的程 度，进一步证明了绿色荧光蛋白可以作为干细胞脂肪分化的观察和检测指标。由此，本专利技术建立了一种，通过绿色荧光 蛋白的表达检测可以用来筛选与脂肪细胞形成相关的药物，尤其是用于筛选促进或者抑 制脂肪形成的药物，也可以用于筛选可以促进或抑制其他类型干细胞脂肪分化的相关化合 物。附图说明在这里，仅通过与实施例的方式来描述本专利技术的内容，与以下的附图有关图1是pLVfinal/pgk-puromycin-aP2-hrGFP慢病毒表达质粒的构建示意图；图 中，携带启动子的入门克隆pUP-aP2、携带绿色荧光报告基因的入门克隆pDown-hrGFP和携 带嘌呤霉素抗性基因的目的载体，在LR克隆酶的作用下发生位点特异的重组反应，得到表 达载体pLVfinal/pgk-puro-aP2-hrGFP，其中hrGFP的表达受aP2启动子的调控。图2是转染前(左图)、转染后(右图)细胞的光镜照片，可见转染后细胞保持细 长梭形，成旋涡状生长，与转染前无明显差异本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种与脂肪细胞形成相关的药物的筛选方法，包括以下步骤：Ａ．提供骨髓间质干细胞的细胞株和相关的培养基与培养条件；Ｂ．提供带有脂肪组织特异启动子及绿色荧光蛋白作为报告基因的慢病毒载体，对所述供骨髓间质干细胞进行转染，引导向脂肪细胞分化，检测分化过程中荧光蛋白的表达，以及对细胞进行鉴定；Ｃ．加入待筛选的药物，检测荧光蛋白的表达情况，如果出现荧光蛋白表达下调或者上调的情形，该化合物成为与脂肪细胞形成相关的潜在候选药物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：项鹏，覃洁，李伟强，余伟华，张丽蓉，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]