多功能珠及用于捕获靶细胞的方法技术

描述了多功能珠和直接从小体积生物样品捕获靶细胞和从这些细胞进行功能和基因组测定的方法。这使用多功能捕获珠完成，其允许单细胞捕获元件和分子测定组分二者共定位。当组合数字微流体平台时，这使得能够将特定单细胞编码和/或条形编码。

Multifunctional beads and methods for capturing target cells

This paper describes multifunctional beads and methods for capturing target cells directly from small biological samples and for functional and genomic determination from these cells. This is accomplished using a multifunctional capture bead that allows both single-cell capture elements and molecular assay components to co-locate. When combined with a digital microfluidic platform, this enables the encoding and / or stripe encoding of specific single cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多功能珠及用于捕获靶细胞的方法联邦资助条款本专利技术在政府资助下在国立卫生研究院授予的合同号1U24AI118667-01下做出。政府在本专利技术中具有一定的权利。与相关申请的交叉引用本申请为于2016年1月19日提交的美国临时申请序列号62/280244的非临时申请，并要求其优先权，所述临时申请的整个公开内容通过引用结合到本文中。背景从混合群体中选择特定细胞的现有方法需要大的样品体积和许多细胞。技术例如MACS(磁性活化的细胞分选)和FACS(荧光活化的细胞分选)用于捕获特定细胞用于转移至后续测定。与分选样品操作相关的细胞损失仍然高，并且稀有的细胞和/或来自非常小的样品体积的细胞丢失。其它技术例如在数字微流体装置中单细胞分析使得能够直接注射单细胞悬液、条形编码和高度平行地分析单细胞。然而，这些装置不以“原始”样品起作用，并且为了起作用细胞必须纯化和稀释在新鲜缓冲液中。这些样品制备步骤导致丢失稀有的细胞/样品，和否定直接注射入微流体装置的效率。因此，尽管分析工具与大规模平行和多参数分析技术保持同步，但样品制备技术尚未与其保持同步。收集特定的细胞类型也是治疗应用例如细胞治疗或组织工程所高度需求的。具体的治疗应用的实例包括但不限于自体或同种异体移植干细胞、移植成熟的功能细胞、修饰的人细胞或异种移植非人细胞。一系列细胞类型需要在修饰、活化和扩增前的分离为高质量的，无残余杂质或防腐剂且适合于这些应用。概述描述了用细胞捕获元件和生物分子捕获元件二者标记的多功能珠，其允许将细胞直接注射入数字微流体测定中，与生物测定所需的至少一种试剂共定位。这解决了现有的高度平行/多参数微流体分析装置与注射稀有的/小体积的原始生物样品所需要的样品制备之间的失配。在一个实施方案中，提供对从生物样品捕获的靶细胞进行测定的方法，其包括使包含生物样品的溶液接触多功能珠。所述多功能珠包含尺寸0.1-100µm的微球体、细胞捕获元件(在微球体的表面上，能够结合靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志)和生物分子捕获元件(在微球体的表面上，能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分)。所述方法涉及将多功能珠与包含靶细胞的生物样品孵育并通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠-结合的靶细胞。靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子通过生物分子捕获元件捕获，所述靶细胞可通过分析捕获的生物分子测定。在一个实施方案中，公开了使用结合靶细胞的珠的方法。所述方法涉及将包含珠-结合的靶细胞的溶液流动通过微流体装置，所述微流体装置具有微流体隔室，和将溶液的珠-结合靶细胞划分到至少一个微流体隔室中。所述方法进一步包括使生物分子捕获元件接触珠-结合的靶细胞，和通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子。还公开一种多功能珠，其包含尺寸0.1-100µm的微球体、细胞捕获元件(在微球体的表面上，能够结合靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志)和生物分子捕获元件(在微球体的表面上，能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分)。附图简述本专利技术的这些和其它特征、方面和优点将会在参考附图阅读下列详述时变得更好地被理解，在附图中相似的符号代表图相似的部件。图1为多功能珠/颗粒的实例。图2a描绘使进入微室中的大体积样品微流体数字化的说明性实例。图2b描绘使微液滴中的大体积样品微流体数字化的说明性实例。图3a和3b为进入微流体数字系统中的泊松(Poisson)装载限制的图示；3A使用微室，3B使用微流体液滴。图4为使用具有多功能珠的数字微流体平台用于确定性的单细胞装载和测定的方法的流程图，显示过程步骤A-D。图5a为使用数字微流体平台和多功能珠的方法的说明性实例；所示出的为用于从主体样品分离细胞和将其各个捕捉到磁性柱上的磁性棘轮(magneticratchet)的实例。图5b为使用图5a和5b的装置的方法的说明性实例；通过将微室阵列放置在装置顶部上方或使用磁性棘轮使细胞向分离室移动，分离细胞到合适的位置。图6a显示缀合至pMHCII四聚体(MHC=主要组织相容性复合体)的珠上的细胞因子结合功能的代表性数据。图6b为显示细胞因子捕获元件在结合重组细胞因子(IFN)中的功能的说明。图6c为细胞因子结合检验的结果的图示，最低测量值为133pg/珠。图7a-7c为显示各个多功能珠用于稀有细胞捕获和分析的功能的直方图；图7a为APC，图7b为PE，图7c为FITC。图8a和8b为来自微孔中捕获的T细胞的细胞因子分泌和捕获的图示；图8a为平均荧光强度的图示，图8b为平均荧光强度的直方图。专利技术详述从生物样品提取靶细胞依然是现代诊断学、细胞生物学研究和细胞治疗的关键需求之一。新技术例如Drop-Seq开创了用于平行分析许多单细胞(转录组)的方法。然而，这些技术仍需要相对大的起始体积和细胞数目(推荐为100个细胞/μL)。正因如此在所收集的生物样品包含稀有的和有限的细胞数目的临床试验中设计作用机制研究仍存在主要约束。此外，有限量的组织、细胞和流体在许多临床研究中均常见，包括从儿科或免疫功能低下的患者收集的样品。需要新的、多参数的、样品节约的(samplesparing)测定以从有限量的生物材料(也可称为生物样品)获得最多的信息。如本文所使用的生物样品可包括，但不限于来自血液或组织样品例如活组织检查的细胞悬液。这些样品可从抽血、针吸、活组织检查取样或任何身体部位组织样本收集。为了响应对改善的用于靶细胞捕获的方法的需求，在某些实施方案中，提供多功能珠或颗粒，其包含细胞捕获元件，例如细胞表面蛋白特异性的抗体或四聚体，和细胞测定元件，例如抗体、核酸或分子以捕获生物分子测定的特定靶。所述多功能珠能够首先捕获细胞并随后经历生物测定中的至少第一个生物分子反应/步骤。在某些实施方案中，反应在微流体装置或微小规模的液体隔室内发生。该过程可用于确保每一捕获的细胞与起始生物分子反应所需的试剂共定位。该独特的多功能珠能够用于驱动确定性装载、装载特定细胞到微室，和为捕获后处理提供至隔室化细胞的通路。在某些实施方案中，描述了直接从小体积生物样品特异性捕获靶细胞的工具和方法并用以从那些细胞进行功能和基因组测定二者。这使用多功能珠完成，其允许单细胞捕获元件和分子测定组分二者共定位。与数字微流体平台组合，这使得能够将特定单细胞编码和/或条形编码。在某些实施方案中，测定也可包括定量生物样品中特定的细胞类型以致特定细胞的数目可计数或估计。除了免疫表型分型之外，所述方法也可用于基因组和转录组以及抗体发现、HLA(人白细胞抗原)分型、单体型分型和药物发现。在某些实施方案中，捕获的靶细胞可在细胞培养中扩增以应用于多能干细胞建库(例如用于诱导的多能干细胞)、细胞的商业化生产(例如，GE的CytivaTM心肌细胞)，和用于治疗应用例如细胞治疗或组织工程或用于临床试验的细胞扩增。例如，在过继性T细胞治疗中进行肿瘤特异性T细胞的分离和离体扩增以获得比仅通过疫苗接种可获得的更大数目的T细胞，允许免疫系统经由可攻击和杀死癌症的T细胞击溃剩余的肿瘤。对于某些细胞治疗应用，靶细胞使用包括使用白细胞介素而免疫调节细胞(即基于T细胞的治疗)或使用重组DNA技术遗传修饰(例如过继性治疗中所使用的细胞)的方法扩增，其后将活化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.对从生物样品捕获的靶细胞进行测定的方法，包括：使包含生物样品的溶液接触多功能珠，所述多功能珠包含：尺寸0.1‑100 µm的微球体；细胞捕获元件，其在微球体的表面上，能够结合所述靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志；和生物分子捕获元件，其在微球体的表面上，能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分；将多功能珠与包含靶细胞的生物样品孵育并通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠‑结合的靶细胞；通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子；和通过分析生物分子捕获元件捕获的生物分子测定靶细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.19 US 62/280244;2016.12.01 US 15/3665201.对从生物样品捕获的靶细胞进行测定的方法，包括：使包含生物样品的溶液接触多功能珠，所述多功能珠包含：尺寸0.1-100µm的微球体；细胞捕获元件，其在微球体的表面上，能够结合所述靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志；和生物分子捕获元件，其在微球体的表面上，能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分；将多功能珠与包含靶细胞的生物样品孵育并通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠-结合的靶细胞；通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子；和通过分析生物分子捕获元件捕获的生物分子测定靶细胞。2.权利要求1的方法，其中靶细胞为稀有的细胞。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述细胞捕获元件为能够结合抗原特异性T细胞的MHC四聚体。4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述捕获元件为能够结合靶细胞上的细胞表面标志的抗体。5.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述生物分子捕获元件为抗体、核酸、寡核苷酸、人工合成的生物活性聚合物、荧光缀合物、金属缀合物或其组合。6.权利要求5的方法，其中所述生物分子捕获元件为抗体。7.权利要求1或权利要求2的方法，其中分析生物分子包括核酸测序、细胞因子分泌分析、定量基因表达、定量生物样品中靶细胞的量、定量生物样品中靶细胞的功能活性或其组合。8.权利要求1或权利要求2的方法，其中分析生物分子包括将选择的靶细胞编码和/或条形编码。9.权利要求1或权利要求2的方法，进一步包括在捕获生物分子之前将珠-结合的细胞转化为液滴的步骤。10.从生物样品捕获靶细胞的方法，包括：使包含生物样品的溶液接触多功能珠，所述多功能珠包含：尺寸0.1-100µm的微球体；细胞捕获元件，其在微球体的表面上，能够结合所述靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志；和生物分子捕获元件，其在微球体的表面上，能够结合所述靶细胞中包含的或由所述靶细胞产生的生物分子组分；通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠-结合的靶细胞；将包含珠-结合的靶细胞的溶液流动通过微流体装置，所述微流体装置具有微流体隔室；将溶液的珠-结合靶细胞划分到至少一个微流体隔室中；使生物分子捕获元件接触珠-结合的靶细胞；和通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子。11.权利要求10的方法，其中所述靶细胞为稀有的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：CM普里奥，EW柯瓦奇斯，BM戴维斯，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：发明
国别省市：美国,US